Wnt-5a Signalling in Human Mammary Cells: Implications for the Development of Breast Cancer

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Wnt-5a-genens betydelse för bröstcellernas normala funktion och för uppkomsten av bröstcancer I min avhandling har jag studerat en i bröstcancersammanhang hittills föga undersökt gen, Wnt-5a. Benämningen Wnt har bildats genom en sammanslagning av "Wingless" (den första identifierade Wnt-genen som orsakar vinglöshet hos bananflugan) och "Int" (från "Integration site" för ett tumörvirus). Wnt-generna spelar en central roll för fosterutvecklingen hos olika arter genom att styra bl. a. celltillväxt, cellmigration och celldifferentiering. Förändringar i Wnt-generna under fosterutvecklingen får dramatiska konsekvenser och kan t. ex. orsaka två överkroppar hos groda (Xenopus laevis) och vinglöshet hos bananflyga (Drosophila melanogater) samt hindra normal hjärnutveckling hos möss. Orsaken till att Wnt-generna har tilldragit sig så stort intresse i cancerforskningen är att man sedan länge har antagit att gener med en central roll i fosterutvecklingen spelar en viktig roll för uppkomsten av cancer. Man har bevisat detta antagande bl. a. genom att visa att när Wnt-1-genen, som styr celltillväxten under fosterutvecklingen men är avstängd i bröstvävnaden hos de vuxna djuren, åter aktiveras i vuxnas bröstceller, leder det till utveckling av bröstcancer. Senare har man upptäckt att det inte är alla Wnt-gener som orsakar cancer utan att det finns två olika klasser. Den ena är Wnt-1-klassen, som bl. a. orsakar överkroppsfördubbling hos groda och som också omvandlar normala celler till cancerliknande (celltransformation). Den andra är Wnt-5a-klassen som omfattar Wnt-5a och ett par andra gener. Det har visats att Wnt-5a-uttrycket inte orsakar celltransformation utan motverkar den celltillväxt som Wnt1-klassen ger upphov till under fosterutvecklingen och hindrar cellrörelsen i grodembryo. För att utöva sin verkan i cellerna har Wnt-5a-proteinet förmågan att aktivera två signalvägar: Wnt/b-cateninvägen (se bild 1 i avsnittet Specific background) och Wnt/kalciumvägen. När en signalväg aktiveras, kommunicerar cellens omgivning och cellkärnan med varandra, och detta styr normala processer såsom celltillväxt. Signaler överförs genom en kedja av signalmolekyler som aktiverar eller inaktiverar varandra. När genetiska defekter uppstår i dessa molekyler, t. ex. genom mutationer, signalerar de ständigt till cellkärnan även utan att det finns någon form av yttre stimuli. Detta gör att cellerna växer okontrollerat och bildar en tumör. Man har visat att defekter på flera molekyler som deltar i Wnt/beta-cateninsignalvägen orsakar koloncancer och melanom hos människa. Denna avhandling har två huvudsyften, dels att undersöka om uttrycket av de molekyler som är viktiga för aktivering av Wnt/beta-cateninsignalvägen, har betydelse för uppkomsten av brösttumörer och dels att ta reda på Wnt-5a:s biologiska funktion i normala bröstceller hos människa och klarlägga betydelsen av förändringar av Wnt-5a-proteinet för utvecklingen av bröstcancer. Vi har isolerat och klonat en gen hos människa som benämns dishevelled (DVL-3) och som är en av de viktiga signalmolekylerna i Wnt/beta-cateninsignalkedjan. En cell med defekter på DVL-3 har förhöjd nivå av beta-cateninproteinet, vilket leder till tumörbildning. Vi analyserade DVL-3-uttrycket i brösttumörer i förhållande till dess mängd i normala bröstvävnader. Det visade sig att DVL-3-uttrycket var ungefär detsamma i tumörer som i normal bröstvävnad, vilket alltså tyder på att denna faktor inte har någon betydelse i detta sammanhang. Vi har också undersökt förändringar i själva beta-cateninproteinet och fann att beta-catenin var ackumulerat i 13% av undersökta brösttumörer. För att ta reda på orsaksambandet undersökte vi uppkomsten av mutationer som gör att det kodade b-cateninproteinet blir resistent mot nedbrytning. Eftersom vi inte hittade några mutationer i beta-cateningenen, antog vi att APC-proteinet, som har funktionen att dämpa beta-cateninaktivitet, kunde vara defekt och ha förlorat förmågan att stimulera nedbrytning av beta-cateninproteinet i dessa tumörer. Det visade sig att förändringar i APC-proteinet inte var så vanliga i bröstcancer som de var i koloncancer. Dessa resultat pekade mot att defekter i andra molekyler som deltar i beta-cateninets signalkedja är ansvariga för ackumulering/aktivering av b-catenin i brösttumörer. Vilka dessa är, återstår att undersöka. Det faktum att Wnt-5a-proteinet uttrycks i normala bröstceller hos vuxna, har jag tolkat som att Wnt-5a-proteinet är viktigt för vissa normala – men ännu okända – funktioner hos dessa celler. Däremot har, som jag visat, de flesta bröstcancercellinjer förlorat Wnt-5a-uttrycket vilket skulle kunna innebära att Wnt-5a-genen hör till de gener som stängs av under cancerutvecklingen. Normalt klassificerar man en sådan gen som tumörsuppressorgen. Intressant nog har en del provrörsstudier på cancerceller i musbröstcellinjer pekat mot att Wnt-5a kunde vara en tumörsuppressor, fastän studier på tumörer hos människa har pekat i motsatt riktning. För att ta reda på om Wnt-5a är en tumörsuppressorgen undersökte jag hur cellerna reagerade när man överuttryckte resp. stängde av Wnt-5a-proteinet. Det visade sig att frånvaro av Wnt-5a proteinet ökar cellens förmåga att sprida sig och migrera genom collagenunderlaget. Den ökade migrationsförmågan kunde jag sätta i samband med att förmågan att häfta fast vid underlaget visade sig vara sämre hos celler som saknade Wnt-5a-proteinet. Ännu viktigare var att jag fann att avsaknaden av Wnt-5a påverkar aktiveringen av en collagenreceptor, DDR1. Jag bekräftade denna upptäckt genom att uttrycka Wnt-5a i MCF-7-bröstcancerceller som tidigare saknade Wnt-5a-proteinet. Jag fann därvid att Wnt-5a-proteinet gav cancercellerna förmåga att aktivera dessa receptorer. Intressant nog förbättrades cancercellernas utseende när Wnt-5a var uttryckt och de liknade nu mera normala bröstceller. Vidare ökades deras förmåga att häfta fast vid varandra, och celldifferentiereringen förbättrades. Eftersom jag hade utvecklat en antikropp mot Wnt-5a-proteinet, undersökte jag hur viktig nivån på Wnt-5a-proteinuttrycket var i invasiva brösttumörer. Det visade sig att Wnt-5a-uttrycket gått förlorat i 44% av de invasiva duktaltumörerna, och de tumörerna hade vissa egenskaper som är karakteristiska för den mest aggressiva tumörfenotypen. Förlust av Wnt-5a i dessa tumörer var starkt knuten till risk att patienten fick återfall. Wnt-5a visade sig således vara en stark och självständig prognostisk faktor: Förlust av Wnt-5a har ett samband med risk att få snabbare återfall och drabbas av tidigare död vid återfall. Denna studie pekar visserligen mot att Wnt-5a-proteinet fungerar som en tumörsuppressor, men innan vi drar några mer långtgående slutsatser bör emellertid ett större klinisk material undersökas. Förlust av olika egenskaper hos bröstcancertumörer kan ge en fingervisning om huruvida patienter kommer att överleva sin sjukdom. Sådana egenskaper kallas prognostiska faktorer. På senare tid har de stora framgångarna i fråga om molekylär analys av förändringar i cancerceller lett till upptäckten av en rad prognostiska faktorer som i viss mån avslöjar graden av aggressivitet hos tumörer. Men för närvarande fungerar inga av dessa markörer helt tillfredsställande och ger inte säker vägledning. Genom att studera och lära oss att bättre förstå de gener som har gått förlorade i cancerceller kan vi förhoppningsvis bättre klassificera, prognostisera och utveckla läkemedel mot cancersjukdomar. Min avhandling torde kunna betraktas som ett bidrag till kunskapen om en viktig cancerrelaterad gen och den försöker svara på frågan om förlusten av denna gen kan spela en roll när det gäller att nedsätta brösttumörcellers förmåga att häfta fast vid underlaget och därmed öka deras förmåga att migrera och bilda metastaser.