The Role of HoxB4 in Hematopoiesis

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish I kroppen produceras varje dag ca 1 000 000 000 000 nya blodceller för att ersätta celler som förbrukats eller sorterats undan som odugliga. I toppen av hierarkin finns den hematopoietiska stamcellen, eller blodstamcellen, en cell med ett antal unika egenskaper: (i) Förmågan att dela sig och ge upphov till minst en ny blodstamcell (cell med samma egenskaper som modercellen) (ii) Förmågan att kunna mogna ut till alla typer av celler som behövs i blodet (iii) Förmågan att vid transplantation till en annan individ kunna tillverka ett helt nytt blodsystem från en enda cell. För att denna massiva cellproduktion skall fungera hela livet, utan att stamcellerna tar slut, måste ett stort antal reglerande faktorer fungera samtidigt för att starta och stänga av olika signalsystem. Vid många sjukdomstillstånd behövs förnyat förråd av blodstamceller. Tillstånd som kräver transplantation av nytt blodbildande system är t ex efter strålbehandling av cancer som allvarligt skadat den blodbildande benmärgen, eller immunbristsjukdomar och andra sjukdomstillstånd som skulle kunna botas med hjälp av benmärgstransplantation. Ett stort problem är dock att tillgången på transplanterbar benmärg är begränsad. I försök med musceller från benmärgen har man kunnat visa att vissa gener styr blodstamcellernas delning så att fler celler kan produceras när behovet finns. Dessa gener kallas transkriptionsfaktorer och kodar för proteiner med uppgift att signalera i cellerna när det är dags att dela sig, mogna vidare eller sluta dela sig. Dessa proteiner kan delas upp och klassificeras efter graden av likhet och många av dem har stått kvar i stort sett oförändrade under evolutionen. Hox-generna är en sådan grupp (eller familj) av gener som anses varandra närstående pga. en gemensam DNA sekvens kallad ”Homeo-box”. Denna sekvens kodar för den DNA-bindande delen av dess protein. Hox-familjen består hos människa (och mus) av 39 gener uppdelade på fyra grupper kallade A, B, C och D vilka är belägna på fyra olika kromosomer. Denna genfamilj har existerat under en väldigt stor del av evolutionen och identifierades först i bananflugor (Drosophila). Där fann man att de hade betydelse för embryots utveckling genom att bestämma var och när olika kroppsdelar skulle utvecklas. I försök kunde man visa detta genom att flytta runt generna vilket resulterade i t.ex. bananflugor med ben på huvudet istället för antenner. Vidare studier avslöjade att många av dessa gener även var av stor betydelse för blodets bildande. Detta upptäcktes efter att flera av Hox-generna kunnat kopplas till kromosomförändringar vid leukemier hos människa. Redan under ett tidigt stadium av embryots utveckling börjar områden i gulesäcken att producera en primitiv variant av blodkroppar. Dessa celler är dock av en art som inte klarar av att producera mogna blodkroppar i en vuxen individ. Kort därefter dyker dock en mer kompetent typ av blodceller upp i en struktur som senare kommer att bygga upp flera organ i embryot, bland annat aorta. Dessa blodceller är början på det livslånga hematopoetiska systemet. Blodet hos en vuxen individ innehåller ett stort antal olika vita blodceller som har till uppgift att försvara kroppen mot angrepp (virus, bakterier, parasiter etc.), blodplättar för att förhindra blödning, samt röda blodkroppar som behövs för att transportera syre till vävnaderna och avlägsna koldioxid. För att rätt celler i rätt antal skall bildas vid rätt tidpunkt måste ett stort antal genprodukter (proteiner) finnas närvarande i cellerna under ett specifikt steg av dess utveckling. Denna reglering är komplex och långt ifrån helt kartlagd. Det är bland annat här som HOX-generna kommer in i bilden. De 39 Hox-generna är som nämnts uppdelade på fyra kromosomer. Där har de tilldelats en siffra mellan 1 och 13 beroende på placering i gruppen. Ju lägre siffra desto tidigare under utvecklingen är de aktiva (dvs HoxB1 före HoxB2 före HoxB3 etc.). En del är känt, men mycket återstår att ta reda på när det gäller regleringen av dessa gener, och även vad de har för funktioner. Det finns olika sätt att studera detta. Här har vi använt oss av två metoder: att studera celler med total avsaknad respektive ökat uttryck av genen. För detta ändamål har vi framställt två musstammar s.k.” knockout” möss – en som helt saknar genen HoxB4, och en som saknar både HoxB3 och HoxB4. Dessutom har vi tillverkat ett rekombinant virus av typen adenovirus (dvs. ett modifierat förkylningsvirus), med uppgift att ta sig in och producera ett överskott av en av dessa gener, HoxB4, i cellerna. Tidigare studier har indikerat, att total avsaknad av en Hox-gen resulterar i en allvarlig skada, möjligen förknippad med minskad chans att överleva. De ”knockout” möss vi framställde var dock friska så långt vi har kunnat avgöra. De föds i normalt antal, har inga synliga defekter och är fertila. Efter att noga ha studerat dessa möss med avseende på deras blodbildande organ har vi kommit fram till att varken HoxB3 eller HoxB4 är nödvändiga för normal funktion. Däremot har vi kunnat konstatera att HoxB4 fungerar som en hjälpmotor eller kanske ett turboaggregat när blodproduktionen utsätts för stress. Vid behov av snabb blodproduktion efter celldöd pga. strålning eller cytostatikabehandling kunde vi se att det tog längre tid för blodcellsproduktionen från knockoutmössen att återhämta sig. Skillnaden mellan avsaknad av enbart HoxB4 och HoxB3 + HoxB4 var liten, men effekten var något starkare när de två generna saknades. Med hjälp av virus kan man tillsätta genmaterial till celler genom att använda sig av en av naturens egna metoder. Normalt skulle ett adenovirus ta sig in i en cell via cellytan. Därefter skulle det stänga av cellens eget försvarssystem och kopiera sig själv för att kunna sprida sig till nya celler. De virus vi använde var modifierade så att de inte längre kunde sprida sig och inte heller göra fler kopior efter att ha tagit sig in i en cell. Däremot bar de med sig genmaterial med koden för HoxB4 så att proteinet kunde produceras. På grund av celldelning och andra mekanismer försvinner viruset från cellerna med tiden. På så sätt fick alla infekterade celler en hög dos HoxB4-protein som efter 1-2 veckor återgick till normala nivåer igen. Syftet med detta var att försöka skapa fler primitiva celler (stamceller) genom att stimulera cellerna till att förnya sig själv (se första kriteriet för stamceller ovan). Vi kunde dock visa att en hög nivå av HoxB4 (15-20 gånger över normalnivå) resulterar i att cellernas primitiva stadium påverkas så att färre primitiva celler blir kvar. Istället mognar de ut mot olika typer av mogna blodkroppar. Genom att slå ihop vår kunskap om HoxB4 baserat på dessa försök, med tidigare publicerade fynd från andra forskare har följande slutsats dragits: En mild (ca fördubbling) ökning av HoxB4 — ökad celldelning (självförnyelse) med bevarad förmåga att producera blodceller av alla sorter Kraftig ökning av HoxB4 (15 gånger över normalnivå) — minskad självförnyelse och därmed förlust av långvarig blodproduktion Total avsaknad av HoxB4 — ingen minskad överlevnad men defekt reaktion på stressituation som kräver nybildning av blodceller Denna kunskap skulle man kunna applicera på transplanterbara blodstamceller då tillgången är begränsad. Den mest skonsamma metoden är troligtvis att använda sig av ett rent HoxB4-protein som skulle kunna tillsättas till cellerna i laboratoriemiljö. Cellerna kunde då expanderas i antal under ett par dagar varefter de transplanterades till patienten.