Mechanisms and time course of cell death in embryonic nigral tissue and intrastriatal transplants

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Parkinsons sjukdom är näst efter Alzheimers sjukdom den vanligaste neurodegenerativa sjukdomen. I Sverige finns ca 15.000-20.000 patienter med Parkinsons sjukdom. Symptomen beror på att en liten grupp nervceller som innehåller signalsubstansen dopamin, dopaminerga celler, gradvis dör av okänd anledning. Patienterna uppvisar muskelstelhet, darrningar och långsamma rörelser. De läkemedel som finns tillgängliga på marknaden är inte optimala eftersom de inte ger tillfredställande symptomlindring under senare faser av sjukdomen. Därför pågår en intensiv forsking om alternativa behandlingar. Hjärncellstransplantat av dopaminerga nervceller till cellernas målområde, striatum, kan minska symptomen dramatiskt hos patienter med Parkinsons sjukdom. I vissa fall har patienter som transplanterats av ett läkarteam i Lund, med embryonal vävnad från substantia nigra, kunnat sluta medicinera och samtidigt återgå till en nästan normalt liv - detta trots upp till 20 års sjukdomshistoria. Emmertid dör upp till 90% av de transplanterade cellerna. Därför måste vävnad från upp till 4-5 embryon användas till varje sida av hjärnan som transplanteras hos patienterna. Det stora behovet av vävnad är ett stort praktiskt problem och har lett till att endast enstaka operationer kan utföras per år. Genom att öka överlevnaden av de transplanterade nervcellerna, skulle behovet av vävnad kunna minskas till kanske ett embryo per sida av varje patients hjärna, vilket skulle göra transplantationsmetoden tillgänglig för betydligt fler patienter. I djurförsök kan transplantations proceduren delas upp i fyra faser: 1) Uttagning av embryon från den dräktiga råtthonan; 2) Dissektion och sönderdelning av främre mitthjärnan (som utvecklas till substantia nigra i vuxna djur) samt förvaring upp till två timmar i samband med implantation av vävanden; 3) Transplantation av embryonal vävnad i striatum hos vuxna råttor, samt även de närmaste dagarna efter implantation; 4) Mognad och utväxt från de transplanterade cellerna. Trots att tidigare studier har visat att de flesta av cellerna dör under preparation av vävnaden eller inom en vecka efter transplantation, vet vi lite om exakt när och hur cellerna dör. Därför är målsättningen med den här avhandlingen att studera celldöden i mer detalj, både före och efter transplantation. Det finns flera olika sorters celldöd, varav apoptos och nekros är be mest studerade. Nekros anses vara en relativt okontrollerad celldöd som resulterar i att cellen går sönder och även skadar omkringliggande vävnad. Celler som dör genom nekros är svullna och med trasiga yttre membran. Apoptos är en form av programmerad celldöd som är energiberoende och där speciella enzymer och gener är aktiverade. Morfologin hos apoptotiska celler är mycket katakteristisk med skrumpning av cellen och kärnan, samt kondensering av kromatinet. Normalt i kroppen äts dessa skrumpna celler upp av andra celler, men under odlade betingelser utanför kroppen övergår de apoptotiska celler i så kallad sekundär nekros. Vi har studerat nervcellsdöd i cell suspensioner preparerade på liknande sätt som de suspensioner som används till transplantation. Cellöverlevnaden har utvärderats genom att använda Trypan blått eller Hoechst / Ethidium Homodimer, som är olika sorters viabilitetsfärgningar. Genom att utvärdera antalet celler som dött samt även räkna antalet celler i suspensionen kan man uppskatta cellsuspensionens hälsa. En annan metod att utvärdera celldöd är genom att mäta mängden laktat dehydrogenas, ett enzym som läcker ut från celler med trasiga membran, i odlingsmediet. Vi har även använt elektronmikroskopi för att titta på cellmorfologin och därför mer exakt kunnat kartlägga celldöden och hur denna förändras över tid i cell suspensionerna. Fria radikaler produceras kontinuerligt vid cell metabolismen och kan orsaka skada om det cellulära försvaret mot radikaler inte är tillräckligt starkt. Därför ha vi även valt att utvärdera frisättning av fria radikaler i cell suspensioner. Transplantationsstudierna i avhandlingen har utförts på vuxna råttor. Transplantaten har utvärderats olika lång tid efter implantation av donatorsvävnaden. Mottagardjuren dödas, deras hjärnorna snittas och utvärderas. Genom att använda specifika markörer för dopaminerga nervceller och olika typer av celldöd har vi kunnat beräkna hur många celler som överlever samt när celldöden är som mest markant. Med hjälp av cell viabilitets infärgningar och elektron mikroskopi, har vi kunnat visa att celldöden börjar redan då embryona tas ut från den dräktiga råtthonan, vilket drastiskt kan minskas om den dräktiga honan dekapiteras istället för sövs. Genom att tillsätta tert-butyl hydroperoxid, som genererar fria radikaler i cellerna, kunde vi studera tidsförloppet av frisättingen av fria radikaler samt när celldöden inträffar. Vi har även studerat några olika mekanismer som kan vara involverade i celldöden i transplantat. Vi har bäddat in de transplanterade hjärnorna i paraffin eller epoxy-plast för att kunna studera de transplanterade cellerna så tidigt som 90 minuter efter implantation, något som aldrig tidigare har rapporterats. Våra intressanta resultat visar att det är en markant celldöd redan efter 90 minuter och ytterligare ca 50% av cellerna dör inom ett dygn efter transplantationen. Dessa resultat ger oss en ny syn på mekanismerna bakom celldöd i transplantat och även information om hur vi eventuellt kan minska den. Eftersom vi observerat celldöd vid ett tidigare skede i vävnads preparationen än vi tidigare har trott, är det viktigt att fokusera våra studier på tiden under och direkt efter preparationen av vävnaden. Det är även intressant att försöka minska celldöden som sker direkt efter transplantation. Vi har utvärderat effekten av resveratrol, en antioxidant som bland annat förekommer i rött vin. Vi rapporterar att tillsatsen av resveratrol till cellsuspensionerna inte bara minskar frisättningen av fria radikaler utan även ökar överlevnaden av cellerna. Hypotermi, dvs sänkt kroppstemperatur, har tidigare rapporterats ha positiv effekt på nervcellsöverlevnad t.e.x i samband med stroke. Därför undersökte vi om en sänkt kroppstemperatur av mottagardjuret i 90 minuter i anslutning till implantation av vävnaden kunde öka överlevnaden av de transplanterade dopaminerga nervcellerna. Resultaten är lovande, då överlevnaden av dopamin cellerna ökar med nästan det dubbla jämfört med transplantat gjorda till råttor med normal kroppstemperatur. Dock är denna metod svår att tillämpa kliniskt då nedkylning av patienter under transplantation är mycket riskabelt. Vårt slutgilitiga mål är att minska den tidiga celldöden i våra transplantat av embryonala dopaminneuron. Upptäckter om nya protektiva substanser är mycket viktiga, kanske avgörande, för bättre funktionell effekt av de kliniska transplantationerna. Kunskaper om olika mekanismer bakom dopaminerg nervcellsdöd är även viktig för att få ökad förståelse för varför dessa nervceller dör i Parkinsons sjukdom. Med resultat erhållna och presenterade i denna avhandling drar vi slutsatsen att protektiva strategier bör tillämpas vid preparationen av donators vävnaden samt under de första dagarna efter implantation.