Glucocorticosteroid effects on cytokine production: studies in a glucocorticosteroid resistance model and in allergic airway disease

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Astma och allergisk rinit (hösnuva) är vanligt förekommande sjukdomar som karakteriseras av inflammation i luftrörs- och nässlemhinnor och ökad produktion av inflammatoriska proteiner t.ex. cytokiner. Cytokiner är små proteiner som fungerar som kemiska signaler mellan celler i kroppen och styr bl.a. inflammationer. Inflammation är kroppens normala försvarsreaktion mot virus och bakterier, eller vid vävnadsskador. Vita blodkroppar/blodceller aktiveras och lockas till inflammationsstället. Inflammatoriska reaktioner kan också utvecklas i luftvägarna t.ex. vid pollenallergisk astma eller rinit. GM-CSF (granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor) är ett cytokin som stimulerar nybildning av vita blodceller och aktiverar och ökar överlevnaden av eosinofila blodceller. Eosinofiler hittas ofta i hög frekvens i blod och lungor hos astmapatienter och i näsan hos rinitpatienter och misstänks bidra till allergisk inflammation. Glukokortikosteroider är hormoner som produceras naturligt i kroppen för att dämpa inflammationer och syntetiskt framställda glukokortikosteroider som inhaleras är de mest använda anti-inflammatoriska astmaläkemedlen idag. Hämning av produktionen av GM-CSF och andra cytokiner kan vara en viktig anti-inflammatorisk effekt av glukokortikosteroider. En liten grupp astmapatienter blir dock inte bättre av glukokortikosteroider, de är resistenta. Deras monocyter och lymfocyter, s.k. mononukleära vita blodceller, är även resistenta mot glukokortikosteroider i laboratorieförsök. Förhöjd produktion av inflammatoriska proteiner t.ex. interleukin-2 (IL-2) och IL-4 anses kunna orsaka resistensen. Hypotesen styrks av att IL-2 och IL-4 orsakar resistens mot glukokortikosteroider i monocyter och lymfocyter från friska personer. Genom att undersöka de mekanismer som orsakar resistens mot glukokortikosteroider kan förhoppningsvis kunskapen om hur dessa läkemedel fungerar ökas. I den här avhandlingen behandlades monocyter och lymfocyter från friska personer med IL-2 och -4 i laboratorium för att inducera resistens mot glukokortikosteroider. Sedan stimulerades cytokinproduktionen med ett bakterieämne (endotoxin) och vi undersökte effekten av glukokortikosteroider på produktionen av olika cytokiner. I arbete I undersöktes först effekten av en vanligt använd glukokortikosteroid, budesonid, på produktionen av tre olika cytokiner från obehandlade monocyter. Produktionen av ett nyligen upptäckt cytokin, IL-12, visade sig mycket känslig för budesonid. I arbete nummer II fann vi att produktionen av GM-CSF blev resistent mot budesonid i monocyter och lymfocyter som hade behandlats med IL-2 och -4. Detta visade att IL-2 och IL-4 inducerade en funktionell resistens mot glukokortikosteroider. Vidare fann vi att effekten av två andra glukokortikosteroider med annorlunda kemisk struktur än budesonid också försämrades. Detta tyder på att IL-2 och -4 troligen inducerar resistens mot alla liknande ämnen. I arbete III studerade vi fyra andra cytokiner förutom GM-CSF. Av dessa fyra blev bara ett cytokin (IL-10) resistent mot glukokortikosteroider. De andra tre (TNF-alpha, IL-8, IL-12) hämmades lika bra efter IL-2 och -4 behandling som i obehandlade celler, dvs. någon generell resistens mot glukokortikosteroider inducerades inte på cytokinnivå. I detta arbete visade vi också att IL-2 och IL-4 inte behövs i kombination för att göra GM-CSF produktionen resistent mot glukokortikosteroider. Detta fynd är i motsats till den ursprungliga hypotesen att just kombinationen av IL-2 och IL-4 krävs för att inducera resistens. Syftet med arbete IV var att undersöka på vilken nivå inuti cellerna som produktionen av vissa cytokiner blev resistent mot glukokortikosteroider. Cytokiner och övriga proteiner bildas genom att s.k. transkriptionsfaktorer binder till generna inuti cellkärnan, mRNA (messenger ribonukleinsyra) bildas (transkription) och transporteras ut i cellen där proteiner bildas med mRNA som ritningar för hur proteinerna ska byggas ihop. Hela denna process har många kontrollställen där den kan regleras av t ex. glukokortikosteroider. Vi fann att IL-10 protein men inte IL-10 mRNA-produktion blev resistent mot glukokortikosteroider efter IL-2 och IL-4 exponering. Detta kan tyda på att resistens mot glukokortikosteroider induceras via mekanismer som påverkar cytokin-produktionen efter det att cytokin mRNA har bildats (post-transkriptionellt). Dessa data motsäger tidigare hypoteser att resistens mot glukokortikosteroider skulle orsakas innan mRNA bildas (pre-transkriptionellt). I arbete VI undersökte vi om glukokortikosteroiders hämmande effekt på GM-CSF produktionen försämras vid ökad allergisk inflammation. Vi valde att studera GM-CSF produktion i blodceller från patienter med björkpollenallergisk astma och rinit. Dessa patienter har ökade astma- och rinitbesvär under våren när björkarna blommar, men är mer eller mindre besvärsfria under resten av året och därför lämpliga för jämförelse av allergimekanismer under symptomatiska och symptomfria perioder. I den här studien valde vi att studera vita blodceller genom att späda blodprover med cellodlingslösning istället för att först isolera enbart monocyter och lymfocyter som man annars brukar göra. Denna typ av cellkulturer innehåller de proteiner som finns i blodet t.ex. inflammatoriska proteiner och inga typer av blodceller tas bort. En fördel är därför att samspelet mellan blodceller i kroppen efterliknas. En nackdel är att blodproteiner och det ämne som används för att blodet inte ska koagulera kan störa vid cytokinanalyser. I arbete V jämfördes därför olika analysmetoder för GM-CSF. Den utvalda metoden visade sig väldigt känslig och kunde även mäta GM-CSF mängder i blod. Vi fann att rinitpatienter hade konstant högre GM-CSF nivåer i blodet än friska personer, oavsett om de hade allergibesvär eller inte. Produktionen av GM-CSF i blodceller förändrades heller inte under björkpollensäsongen och skiljde sig inte åt mellan astma- och rinitpatienters och friska personers blodceller. GM-CSF produktionen hämmades kraftigt av budesonid i celler från såväl kontrollpersoner som från astma- och rinitpatienter. GM-CSF produktionens känslighet för budesonid förändrades inte under björkpollen säsongen. Detta indikerar att produktion av proinflammatoriska proteiner vid ökad allergisk luftvägsinflammation inte försämrar cytokinproduktionens känslighet för glukokortikosteroider. Sammanfattningsvis visar denna avhandling att produktionen av vissa cytokiner kan bli resistent mot glukokortikosteroider om monocyter och lymfocyter exponeras för IL-2 och/eller IL-4, men att cytokinproduktion generellt inte blir resistent mot glukokortikosteroider. Vidare visas att allergisk inflammation orsakad av björkpollen inte försämrar glukokortikosteroiders hämmande effekt på cytokinproduktion från blodceller hos patienter med björkpollenallergisk astma och rinit. Detta stämmer överens med att glukokortikosteroider är effektiva som behandling hos majoriteten av patienter med allergisk astma och rinit.