The effect of sequence truncation and amino-acid substitutions on the biophysical properties of protein S and calbindin D9k

Detta är en avhandling från Karin Julenius, Physical Chemistry 2, Lund University, P.O.B. 124, S-221 00 Lund, Sweden

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Proteiner är helt nödvändiga för alla former av liv på jorden. En typisk cell består till 50-60 % av proteiner, om man bortser från vatten. Det är ett protein, hemoglobin, som transporterar syre från lungorna till kroppens celler och ger blodet dess röda färg. Det är ett protein, alfa- keratin, som bygger upp vårt hår och våra naglar. Det är två proteiner, aktin och myosin, som ligger i omväxlande lager i våra muskler och glider längs varandra när vi spänner dem. Men det finns också en stor mängd osynliga proteiner i vår kropp som styr alla de kemiska reaktioner som sammantaget kallas liv. Dessa kallas enzymer. Vi har enzymer som bryter ner maten vi äter till molekyler, enzymer som omvandlar mat- molekylerna till energi, enzymer som använder denna energi till att bygga upp nya molekyler o s v. Proteiner är nödvändiga för alla livsfunktioner. Proteiner är uppbyggda av aminosyror. Det finns 20 olika slags aminosyror och dessa sitter ihop i en lång rad, ungefär som pärlor på ett halsband. Ordningen på aminosyrorna är mycket viktig, och det är detta som skiljer ett protein från ett annat. Storleken kan också variera från ca 50 aminosyror till flera tusen. Information om i vilken ordning cellen skall sätta ihop aminosyrorna för att få ett visst protein finns lagrat i generna. Varje gen har information om aminosyrasekvensen hos ett protein och människans arvsmassa innehåller uppemot 100 000 gener. Vår arvsmassa är ingenting annat än ett bibliotek med mallar för alla mänskliga proteiner. Alla dessa proteiner produceras dock inte i alla celler, eftersom cellerna i människans kropp är specialiserade på olika saker. Dessutom innehåller arvsmassan dubletter av vissa gener, eventuellt som en slags säkerhetskopior om det skulle vara fel på en av generna. Det kan nämligen förekomma fel i arvsmassan, s k mutationer. Då blir proteinet felkonstruerat och detta kan leda till ärftliga sjukdomar och i allvarliga fall till spontan abort redan i moderlivet. En ärftlig sjukdom som t ex blödarsjuka kan orsakas av att så lite som en enda aminosyra har blivit felaktigt utbytt mot en annan. Det faktum att våra gener i själva verket är protein-mallar får oss att förstå hur viktiga proteinerna är. Det som ger olika människor olika utseende och olika personligheter beror i grund och botten på skillnader i förekomst och/eller sekvens hos deras proteiner. Även om proteinerna är schematiskt uppbyggda som långa halsband så är det inte så de ser ut i sitt normaltillstånd. I sina naturliga miljöer veckar de ihop sig på mycket specifika sätt till strukurer som ser ut som nystan. Proteinerna är i sitt veckade tillstånd mellan 2 och 10 nm stora (1 nm är 1 miljondels eller 0.000 001 mm). Ett visst protein veckar sig alltid på samma sätt, så informationen måste finnas i aminosyrasekvensen självt, men de krafter som styr hur proteinet skall vecka sig är komplicerade och forskningen har ännu inte lyckats räkna ut strukturen hos ett protein från enbart information om sekvensen. Det är bara det veckade, nystan-lika proteinet som har någon funktion i kroppen. All ny forskning som kan hjälpa oss att förstå de krafter som håller ihop dessa strukturer är därför värdefull. Många proteiner, eller delar av proteiner, binder till andra molekyler, joner eller till andra proteiner. Dessa interaktioner är oftast mycket viktiga för att proteinet skall kunna fungera i kroppen. Ett sätt att lära sig mer om t ex ett kalciumbindande protein och dess funktion är därför att mäta styrkan i bindningen till dess kalcium-jon. Ett annat sätt att lära oss mer om proteiner och krafterna som håller ihop dem är att mäta hur mycket de tål, d v s att utsätta dem för saker som gör att de vecklas upp, blir halsbands-lika och därmed förlorar sin biologiska funktion. Detta kallar vi att mäta proteiners stabilitet. Man kan också utnyttja modern genteknik, som ger oss möjlighet att lura en bakterie att producera ett protein med godtycklig aminosyrasekvens, modifiera ett protein efter eget huvud och studera följderna. När ett blodkärl går sönder bildas en propp bestående av proteinet fibrin och blodplättar för att hindra blodet från att läcka ut - blodet koagulerar. Detta bör ske snabbt och effektivt, men bara lokalt där skadan skett. Vi vill ju inte att hela blodomloppet skall koagulera. Därför krävs ett komplicerat system med ett 20-tal proteiner där vissa bidrar till att proppen bildas och vissa motverkar denna process. Balansen i detta system är känslig och därför finns det även ett antal kända ärftliga defekter. Om koagulations-proteinerna fungerar dåligt får man blödarsjuka och om anti-koagulations-proteinerna fungerar dåligt får man förhöjd risk för blodpropp. Protein S är ett anti-koagulations-protein som finns i blodet. Det är ett stort protein och består av sex olika moduler. Varje modul är ett protein-nystan och dessa i sin tur sitter på en lång rad. De fyra mittersta liknar varandra till strukturen. Denna typ av modul finns i många olika proteiner och har fått namnet EGF-modul. Tre av dessa fyra EGF-moduler binder kalcium och tidigare studier på protein S som helhet har indikerat att någon eller några av dessa binder kalcium ovanligt starkt. För att öka förståelsen för vad som orsakar denna starka kalciumbindning har jag mätt kalcium-bindningen på enskilda EGF- moduler efter att dessa har producerats en och en utan sina grannar. Det visar sig då att kalcium-bindningen är högst ordinär. Data från en studie som gjordes parallellt visar dock att EGF-modul nummer 4 binder kalcium betydligt starkare i närvaro av de övriga EGF-modulerna. Detta tyder på att dessa binder till varandra på något ännu okänt sätt. För att en så stor organism som människan skall kunna fungera krävs det att de olika delarna kommunicerar med varandra. Detta sker genom nervsystemet och genom att hormoner utsöndras i blodet. I båda fallen är det viktigt att kalcium-koncentrationen inuti cellerna hålls på en viss nivå, eftersom vissa signaler överförs genom att kalcium- koncentrationen i cellen höjs dramatiskt. För att detta skall kunna ske kontrollerat krävs att normal-nivån är stabil. Calbindin D9k är ett litet protein som binder kalcium starkt. Dess biologiska funktion är inte helt bevisad, men allt tyder på att dess funktion är dels att transportera kalcium och dels att stabilisera kalcium-koncentrationen i cellerna. Calbindin D9k är uppbyggt på liknande sätt som ett 30-tal andra kalciumbindande proteiner med olika funktioner. Jag har arbetat med ett antal mutanter av calbindin D9k och mätt deras stabilitet. Genom att studera ett antal proteiner som bara skiljer sig från varandra med en aminosyra kan man uppskatta hur mycket denna aminosyra bidrar till att proteinet hålls samman. Mina studier visar att aminosyrorna i proteinets mitt är mycket viktiga för stabiliteten. Det var känt sedan tidigare att mutationer som innebär en minskning i storlek hos en aminosyra har denna effekt, men jag har visat att detta är sant även för mutationer där storleken hos aminosyran ökats. Jag har även klyvt calbindin D9k i två halvor och renat upp halvorna var för sig. När dessa halvor binder kalcium dimeriserar de, d v s de binder till varandra, två och två. Denna dimerisering sker både mellan identiska halvor (homo-dimerer) och mellan de två olika halvorna (hetero-dimerer). Jag har utvecklat en metod att mäta homo-dimerisering och jag har använt denna metod för de två halvorna från calbindin D9k. Det visar sig att den ena halvan lättare dimeriserar än den andra, troligen därför att den andra är starkt negativt laddad, vilket ger repulsion. För övrigt har dessa dimerer flera egenskaper gemensamma med det oklyvda proteinet. Slutligen har jag fäst den ena halvan av proteinet på en yta och mätt inbindningen av den andra halvan till denna. När jag jämför resultaten för olika mutanta halvor med resultaten från stabilitetsstudien finner jag att de mutationer som försämrar stabiliteten mest också försämrar bindningen mellan de bägge halvorna.

  Denna avhandling är EVENTUELLT nedladdningsbar som PDF. Kolla denna länk för att se om den går att ladda ner.