Transforming Growth Factor-b, Regulatory functions on normal lymphocytes and tumor outgrowth Regulatory functions on normal lymphocytes and tumor outgrowth

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish För att en multicellulär organism som männinskan ska kunna fungera måste celldelningen strikt kontrolleras. Protein som reglerar celldelning på cellulär nivå kallas för "tillväxtfaktorer". Vi har studerat ett sådant protein som kallas för transforming growth factor-beta (TGF-b). Namnet TGF-b kommer sig utav att detta protein kan transformera (omvandla) epiteliala njurceller så att de delar sig obehindrat. TGF-b är annars i de flesta andra sammanhang mest känd för att hämma tillväxt av celler. Immunförsvarets celler kan delas upp i två grupper. Det naturliga försvaret utgörs av makrofager och neutrofiler vilka fagocyterar (äter) patogener. Det adaptiva (förvärvda) försvaret utgörs av lymphocyter (T- och B-lymfocyter) som "minns" patogenen och som vid en andra infektion därför kan försvara kroppen snabbare och mer specifikt. Denna avhandling är fokuserad på att studera den effekt som TGF-b har på två aktörer i immunförsvaret, T-lymfocyterna (som delas upp i T-cytotoxiska- och T-hjälpar-celler) från det adaptiva försvaret och makrofagerna från det naturliga försvaret. I min första studie kunde vi påvisa en skillnad i den effekt TGF-b har på T-lymfocyters tillväxt, beroende på vilket lymforgan som T-lymfocyterna kom ifrån. T-lymfocyter från lymfknutorna hos råtta hämmades i sin tillväxt medan T-lymfocyter från mjälten stimulerades i sin tillväxt vid TGF-b tillsatts. En avgörande skillnad mellan mjälten och lymfknutorna är andelen makrofager. I mjälten finns det ca 20% makrofager medan lymfknutor endast innehåller ca 3%. Vi renade därför fram makrofager från mjälten och satte dessa till celler från lymfknutorna. Då kunde en stimulerande effekt av TGF-b även ses med T-lymfocyter från lymfknutorna. Framrenade B-lymfocyter kunde, till skillnad mot makrofagerna, ej vända den hämmande effekten hos TGF-b till en stimulerande effekt på T-lymfocyternas tillväxt. Vi visade också att TGF-b enbart stimulerar ostimulerade T-lymfocyter. Redan aktiverade T-lymfocyter hämmas, vilket visar att TGF-b har en immunmodulerande funktion. Det har tidigare visats av andra forskare att TGF-b stimulerar T-lymfocyters tillväxt i början av en immunreaktion men stoppar T-lymfocyters aktivering i slutet av immunreaktionen via tillväxtinhibibering. Den stimulerande effekten av TGF-b på T-lymfocyter kunde påvisas på både cytotoxiska T-celler (CD8+) och T-hjälpar celler (CD4+). Ett ökat uttryck av IL-2 receptorn (aktiverings markör) erhölls (tabell 2). I mitt andra arbete har jag visat att TGF-b också ökar antalet lymfocyter och minskar antalet apoptotiska lymfocyter (celler som fått "dödssignal"). Antalet apoptotiska B-lymfocyter minskade i större utsträckning jämfört med antalet T-lymfocyter. Jag har jämfört de tre isomera formerna av TGF-b och deras effekt på T-lymfocyt aktivering och visat att TGF-b2 och TGF-b3 stimulerar T-lymfocyterna redan vid ca en 1/10-dels lägre koncentration än TGF-b1. Däremot kunde jag inte påvisa på någon skillnad i förmågan att minska antalet apoptotiska celler hos lymfocyterna. Vi fann också att TGF-b1´s förmåga att reducera antalet apoptotiska celler inte berodde på nedreglering av cytokinen TNF-a, vilken av andra forskare har visats inducera apoptos hos celler. I mitt tredje arbete undersöktes vilka cytokiner (lösliga substanser som påverkar lymfocyter) som utsöndras från T-lymfocyter respektive från monocyterna vid TGF-b1-inducerad stimulering eller då TGF-b1 hämmar lymfocyterna. T-hjälpar celler (Th) delas upp i två grupper, Th1 och Th2, beroende på vilka cytokiner de utsöndrar. Vi visar att TGF-b1 ger minskad produktion av Th1 cytokinen IFN-g både då TGF-b1 hämmar eller när TGF-b1 stimulerar T-lymfocyters tillväxt. TGF-b1 ger däremot en ökad produktion av Th2 cytokinen IL-10 enbart när TGF-b1 stimulerar T-lymfocyters tillväxt. En ökad IL-10 produktion vid TGF-b1 tillsatts kunde påvisas hos både monocyter och T-lymfocyter. För att förstå vilken cytokinförändring som är avgörande för den stimulerande effekten på T-lymfocyters tillväxt, ökades IL-10 produktionen genom tillsatts av rekombinant rått IL-10, medan IFN-g produktionen minskades genom tillsatts av antikroppar mot IFN-g. Vi såg endast en ökad tillväxt, liknande den vid tillsatts av TGF-b1, när vi tillsatte IFN-g antikroppar, vilket visar att minskningen av IFN-g är avgörande för TGF-b1 beroende stimulering av T-lymfocyters tillväxt. Vi fann också att TGF-b1 först måste binda till monocyterna för att verka stimulerande på T-lymfocyterna och i nästa steg måste monocyter och T-lymfocyter befinna sig i fysisk kontakt med varandra. I mitt fjärde arbete har vi studerat hur de intracellulära signaleringsvägarna påverkas av TGF-b1. När TGF-b1 stimulerar T-lymfocyters tillväxt så hämmas aktiveringen av det intracellulära proteinet ERK (extracellular signal-regulated kinase, ett MAP kinas). Andra forskare har visat att ERK kan fosforylera Smad2 och Smad3 (proteiner som verkar i TGF-b signaleringen) och därmed minska de celltillväxthämmande signaler TGF-b ger lymfocyten. Minskningen av aktiverad ERK kan också induceras av MEK-1 hämmare. MEK-1 hämmare blockerar fosforylering av MEK-1 så att ingen aktivering av ERK kan ske. Vi har använt oss utav två olika MEK-1 hämmare PD098059 och U0126. Vid tillsatts av dessa hämmare induceras liknande stimulerande effekt på T-lymfocyters tillväxt som vid TGF-b1 tillsatts. MEK-1 hämmare och TGF-b1 verkar också additativt på T-lymfocyters tillväxt. I likhet med TGF-b1 så måste MEK-1 hämmaren först binda till monocyterna för att verka stimulerande på T-lymfocyternas tillväxt. Cytokinproduktionen hos T-lymfocyter och monocyter, som inducerats antingen av MEK-1 hämmaren PD098059 eller av TGF-b1 jämfördes. I likhet med TGF-b1 så reducerar PD098059 produktionen av IFN-g och tillsammans blockerar de produktionen av IFN-g totalt. Till skillnad mot TGF-b1 så ökar inte PD098059 produktionen av IL-10. Däremot minskar PD098059 produktionen av TNF-a, vilket TGF-b1 också gör i en mindre utsträckning. Tillsammans blockerar de den totala produktionen av TNF-a. I mitt sista arbete har jag studerat påverkan av TGF-b1 på tumörtillväxt. Jag använde en colon (tjocktarms) tumör som ej producerar någon detekterbar mängd TGF-b1. Denna tumör transfekterades (att föra in gener i celler m h a virus) med genen för TGF-b1. Samtidigt transfekterades tumören med endast vektor (utan TGF-b1 genen) som kontroll. Tumörcellerna sprutades in under leverkapseln hos råttor för att efterlikna humana colontumörers tillväxtmönster som ofta leder till metastaser i levern. Den TGF-b1-transfekterade tumören växte märkbart långsammare jämfört med kontrolltumören i immunkompetenta råttor (djur med intakt immunförsvar). Den TGF-b1-transfekterade tumör infiltrerades i högre grad av T-lymfocyter jämfört med kontrolltumören. Infiltrationen I tumören av både CD4+ och CD8+ T-lymfocyter var 4 gånger högre jämfört med kontrollen. För att påvisa om den långsammare tilltväxten hos den tumör som transfekterats med TGF-b1 är T-lymfocytberoende så sprutades både den TGF-b1-transfekterad tumör och kontrolltumören in i immun-inkompetenta SCID möss dvs möss som saknar funktionsdugliga T- och B-lymfocyter. Även i dessa djur växte den TGF-b1-transfekterade tumören långsammare än kontroll tumören. Infiltrationen av både granulocyter och makrofager (celler från det naturliga försvaret) fördubblades i de TGF-b1-transfekterade tumörerna jämfört med kontrolltumörerna hos dessa djur. Även produktionen av både den immunosuppressiva cytokinen IL-10 och den tumör dödande (apoptos inducerande) cytokinen TNF-a ökade i T-lymfocyter från den TGF-b1-transfekterade tumörerna jämfört med T-lymfocyter från kontrolltumörerna.