Monoglyceride Lipase and Hormone-Sensitive Lipase - Molecular and structural aspects

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Förmågan att ha tillgång till energi oberoende av ett varierande födointag är livsavgörande. Kroppen har därför på ett högst effektivt sätt löst detta genom att lagra energi i form av fett i fettceller, vilka finns i fettväven. Dessa fettdepåer, vilka utgörs av triglycerider (en triglycerid består av ett glycerol med tre påkopplade fettsyror), byggs upp då födointaget är större än energibehovet och bryts ner när det omvända förhållandet råder, t.ex. under fasta och vid kroppsansträngning. Hormon-känsligt lipas (HKL) och monoglyceridlipas (MGL) är de två enzymer (proteiner som katalyserar (påskyndar) en reaktion utan att själv förbrukas) som tillsammans ansvarar för nedbrytningen av triglyceriderna i fettväven, vilken sker i tre steg genom att en fettsyra i taget frisätts. HKL katalyserar ensamt de två första stegen, medan det sista steget huvudsakligen katalyseras av MGL. De frisatta fettsyrorna lämnar cellen och transporteras i blodet till t.ex. muskel- och hjärtceller där de tas upp och ger energi genom förbränning. För att fettet ska brytas ner krävs molekyler som signalerar till cellen att energi behövs. Dessa s.k. signalsubstanser (hormonella eller nervösa), såsom adrenalin och noradrenalin, binder till speciella receptorer (mottagare) på fettcellens yta. Detta leder till att det inuti cellen sker en kaskad av reaktioner. En av de slutliga reaktionerna är att HKL fosforyleras (en kemisk modifiering där fosfat kopplas till speciella aminosyror), vilket gör att HKL:s aktivitet ökar och därigenom bryts fettet ner. Hormonet insulin, vilket frisätts då blodsockret stiger efter en måltid, signalerar däremot till fettcellen att energi redan finns tillgänglig och att det lagrade fettet således inte behöver brytas ner. De reaktioner inne i cellen som insulin ger upphov till åstadkommer en minskad grad av fosforylering, och därmed också en minskad aktivitet, av HKL. Reglering genom fosforylering är troligen en unik egenskap hos HKL jämfört med andra lipaser (fettnedbrytande enzymer). MGL kompletterar således HKL i frisättandet av fettsyror utan att påverkas av signalsubstanser. Då min avhandling baseras på molekylära och strukturella aspekter av HKL och MGL följer här förklaringar av de mest centrala begreppen. Proteiner är makromolekyler som är uppbyggda av ca. 20 olika sorters aminosyror, vilka binder till varandra i långa kedjor. Ett proteins primärstruktur anger i vilken ordning aminosyrorna är ihopkopplade. Proteinkedjan kan vecka sig i olika regelbundna strukturer, bl.a. alfa-helixar (spiraler) och beta-strängar (avsnitt av proteinkedjan som veckar sig fram och tillbaka till en någorlunda flat yta, ett s.k. beta-flak). Proteinets sekundärstruktur anger detta veckningsmönster. Vidare bildar dessa regelbundna strukturer mer eller mindre sfäriska molekyler som kallas globulära proteiner. Proteinets tertiärstruktur beskriver i detalj proteinkedjans veckning i ett globulärt protein. För att aminosyrorna i ett protein ska kopplas ihop i rätt ordning behövs en mall. Dessa mallar finns i de flesta av kroppens celler i form av ämnet deoxyribonukleinsyra (DNA), vår arvsmassa. DNA är uppbyggt i långa kedjor av fyra olika s.k. nukleotider, benämnda A, G, T och C. En kombination av tre nukleotider i rad motsvarar en speciell aminosyra. I människans celler finns det 46 DNA-kedjor (23 kedjor i könscellerna) och de kallas kromosomer. Utspridda på kromosomerna finns gener, DNA-avsnitt som bestämmer hur proteinerna ska se ut. Gener hos flercelliga organismer består av flera exoner, de DNA-bitar där själva mallen för proteinsyntesen finns, och introner, oftast relativt långa bitar av DNA som finns placerade mellan exonerna. Vid proteintillverkning översätts först DNA-informationen till ribonukleinsyra (RNA), som också består av nukleotider (en skillnad är att T är utbytt mot en annan nukleotid, U). Intronerna klyvs sedan bort från RNA-kopian, vilken därefter lämnar cellkärnan och når ut i en annan del av cellen där proteintillverkningen sker. Primärstrukturen för MGL i fettväv (både hos mus och människa) har bestämts (delarbete I och IV). Den består av 302 aminosyror och mellan arterna är 250 av dessa identiska, d.v.s. samma sorts aminosyra finns på samma plats i respektive proteinkedja. Studierna visar också att MGL inte bara finns i fettväv utan troligen i kroppens flesta (alla?) vävnader (t.ex. muskel, hjärta, lunga och hjärna). I musfettväv (och andra vävnader) finns det två olika RNA-kopior för tillverkning av MGL-protein. Hur de olika RNA-kopiorna kopiorna uppkommer och hur de används vid proteintillverkning är inte känt. Det finns också skillnader hos proteinet mellan olika musvävnader. MGL är något större i muskel och något mindre i testikel än i de övriga analyserade vävnaderna (njure, mjälte, hjärta, lever, mage, lunga, binjure och fettväv). Dessutom finns det i hjärna två MGL-protein med olika storlek. Vad dessa skillnader beror på är inte känt. För MGL och HKL har en modell av deras respektive tertiärstruktur tagits fram (delarbete I och II). Man kan utifrån ett proteins primärstruktur ta fram den mest troliga placeringen av de olika sekundärstruktur-elementen (alfa-helixar och beta-strängar, se ovan). Om det visar sig att dessa element har samma generella placering som i protein där strukturen redan är känd (t.ex. genom röntgenkristallografi, den metod som vanligtvis används för bestämning av proteiners verkliga struktur), kan man med olika datoriserade modelleringsprogram ta fram en modell av tertiärstrukturen. För HKL och MGL var detta möjligt. Det visade sig att båda dessa proteiners struktur uppvisar s.k. alfa/beta-hydrolasveckning. Denna veckning finns hos alla lipaser med känd struktur och den består av ett beta-flak omgivet av ett varierande antal alfa-helixar. Vissa delar av primärstrukturen för både HKL och MGL gick dock inte att modellera, p.g.a. att det inte finns någon likhet med andra protein, varken i primär- eller sekundärstruktur. Dessa delar innefattas dock inte av den för lipaser generella alfa/beta-hydrolasveckning utan är troligen separat veckade strukturer med speciella funktioner. Ett exempel är den del hos HKL där reglering genom fosforylering sker (se ovan). Utifrån respektive modell kunde även den katalytiska triaden identifieras. Den består av tre speciella aminosyror (en serin, en asparaginsyra eller en glutaminsyra, och en histidin) som hos alla lipaser är direkt involverade i fettsyrafrisättningen. Dessa tre aminosyror i MGL muterades (byttes ut på ett genteknologisk sätt) en i taget, vilket resulterade i att MGL-proteinets katalytiska egenskaper försvann. Detta visar att rätt aminosyror identifierats och även att modellen av MGL:s tertiärstruktur troligen överrensstämmer väl med den verkliga strukturen. Ett sätt att ta fram stora mängder rent MGL-protein har etablerats (delarbete III). Man kan nämligen med hjälp av modern genteknologi få speciella celler att fungera som fakriker för tillverkning av olika proteiner (utifrån det önskade proteinets DNA) och när det gäller MGL användes en sorts insektsceller. För att på ett enkelt sätt kunna rena fram proteinet ur cellerna förändrade vi MGL:s DNA (genteknologiskt) så att proteinet tillverkades med sex stycken histidiner (en sorts aminosyra) i ena änden. Histidiner binder väldigt starkt till nickel och baserat på denna bindning gick det att få fram nästan rent MGL-protein. När den katalytiska aktiviteten hos detta framrenade proteinet jämfördes med den för ett protein som tidigare renats fram ur fettceller framkom inga uppenbara skillnader. Således utgör det på genteknologisk väg framtagna MGL-proteinet en bra källa för vidare studier (se nedan). Genen hos mus som innehåller informationen för tillverkning av MGL-proteinet har karaktäriserats (delarbete IV). Den består av mer än 18 000 nukleotider och innehåller mer än sju exoner och sex introner. Genen har även lokaliserats till kromosom 6, vars motsvarande region finns på kromosom 3 hos människa. Inga gener med koppling till sjukdomar associerade med rubbning i fettomsättningen har hittills lokaliserats till dessa kromosomregioner. Målet med de beskrivna studierna har bl.a. varit att ta fram redskap för vidare studier av både MGL och HKL. Kännedom om MGL:s primärstruktur har redan gjort att vi har kunnat etablera ett system för storskalig proteinproduktion. Detta protein kommer bl. a. att användas för strukturbestämning av MGL med röntgenkristallografi, vilket kräver stora mängder (flera milligram!) rent protein. Modellerna av MGL:s och HKL:s tertiärstruktur kan bl.a. användas till att lokalisera aminosyror som kan vara av betydelse för speciella egenskaper hos proteinerna, beroende på deras placering i tertiärstrukturen. Karaktärisering av genen för MGL är ett första steg i att få fram s.k. ”knock-out” möss. Detta innebär att genen hos möss på genteknologisk väg förändras så att MGL-proteinet inte tillverkas, vilket kan leda till en ökad förståelse av MGL:s fysiologiska roll i olika vävnader hos den levande organismen.