The role of PKC in neuronal differentiation and in regulation of the actin cytoskeleton during neurite outgrowth
Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Proteinkinas C (PKC) är en familj enzymer (protein som påskyndar cellulära förlopp) bestående av åtminstone 10 medlemmar (isoformer) vilka är involverade i ett flertal cellulära processer. Varje isoform är namngiven med en grekisk bokstav och beroende på olika egenskaper hos enzymerna kan PKC familjen delas in i tre undergrupper, de klassiska (α, βΙ, βΙΙ och γ), de nya (δ, ε, η och θ) och de atypiska (ζ och ι/λ) isoformerna. Strukturen av PKC kan delas in i två delar, varav ena halvan utgör den katalytiska domänen, vilken innehar den enzymatiska aktiviteten hos proteinet. Den andra halvan utgör den regulatoriska domänen, vilken binder ämnen som reglerar aktiviteten hos enzymet. PKC regleras normalt av faktorer så som fettmolekylen diacylglycerol och kalcium joner. Dessa aktivatorer leder till att PKC förflyttas ut till cell membranet, vilket är det yttre höljet som omger cellen, där det aktiveras. De klassiska och nya isoformerna kan även förflyttas och aktiveras artificiellt genom tillsats av en grupp kemikalier, så kallade forbolestrar. Neuroblastom är en barntumör i det sympatiska nervsystemet som uppstår när en omogen nervcell förlorar förmågan att utvecklas till en mogen nervcell och istället förökar sig ohämmat, vilket leder till att en tumör bildas. Celler från sådana tumörer kan isoleras och odlas i cellodlingsskålar, vilket ger en möjlighet att studera deras egenskaper. Tidigare studier har visat att genom att behandla cellerna med forbolestrar under en lång tid så slutar tumörceller växa och mognar (differentierar) istället. De behandlade cellerna har ökat produktionen av proteiner specifika för mogna nervceller samt förändrat sitt utseende genom utväxt av utskott (neuriter). Olika PKC isoformer har visat sig vara inblandade i de olika processerna. Klassiska isoformer är inblandade i regleringen av proteinproduktionen, medans de nya isoformerna är viktiga för neuritutväxten. Genom att använda olika kemiska ämnen som specifikt hämmar den katalytiska aktiviteten har vi i ett delarbete visat att en PKCβ isoform är inblandad i regleringen av proteinproduktionen som sätts igång efter behandlingen med forbolestrar. Eftersom forbolestrar aktiverar ett flertal PKC isoformer och de flesta kemikalier som hämmar deras aktivitet blockerar fler än en isoform så är det svårt att definiera vilken isoform som är ansvarig för en viss effekt. Genom att föra in flera kopior av genen för en specifik PKC isoform i cellerna så leder det senare till en ökad mängd av själva proteinet. Detta härmar en aktivering av proteinet och man får därmed en indikation på vilka cellulära processer just den isoformen är inblandad i. Tidigare resultat från vår grupp har visat att ökad mängd av PKCε i cellerna leder till neuritutväxt hos neuroblastomcellerna. Denna effekt var oberoende av den katalytiska aktiviteten och medierad via den regulatoriska domänen. I den här studien har vi fortsatt att undersöka mekanismen bakom den här effekten. Våra resultat visar att neuritutväxten inte bara är oberoende av den katalytiska aktiviteten, utan att den faktiskt motverkar den neurit-inducerande förmågan hos den regulatoriska domänen. Vi fann även att ökad mängd av PKCε ger neuritutväxt i neuronala celler som inte härstammar från tumörer, vilket visar att effekten inte beror på någon abnormalitet som kan finnas i tumörceller. Även i icke-neuronala celler, så som fibroblaster (finns i bindväven), inducerar PKCε utväxt av långa utskott, vilket betyder att PKCε påverkar mekanismer som finns i flera olika celltyper. I motsatts till PKCε så ger överuttryck av PKCδ inte någon utväxt. Vi upptäckte dock att genom att stimulera celler som har förhöjd mängd av PKCδ med forbolestrar så kan utväxten av utskott induceras. Detta gav oss ett modellsystem för att studera de initiala förändringarna som sker under utväxten av långa utskott, vilket är beroende av dynamiska förändringar av cellens skelett, kallat cytoskelett. Detta är uppbyggt av tre olika strukturer vilka alla ger upphov till långa ”trådar” (filament). En av dessa strukturer är aktin-cytoskelettet, vilket är reglerat av så kallade små G-bindande proteiner tillhörande Rho-familjen. De mest studerade medlemmarna av denna familj är RhoA, Rac1 and Cdc42, vilka ger upphov till tydliga strukturer av aktin-cytoskelettet. RhoA leder till ”stressfiber” vilka består av flera aktinfilament hopbuntade till kraftiga fibrer som sträcker sig över hela cellen från ena sidan till den andra. Rac1 och Cdc42 ger mer dynamiska strukturer på cellytan, vilka är viktiga för migrationen av hela celler eller av tillväxtkonen, vilket är en struktur längst ute på neuriten som känner av omgivningen och leder utväxten. Generellt så är deras effekt på neuritutväxt att RhoA hämmar, medans Rac1 och Cdc42 har en positiv inverkan på utväxten. Vi fann att neuritutväxten är åtföljt av en förlust av stressfibrerna, vilket tyder på att aktiviteten hos RhoA är nedreglerad. En muterade variant av RhoA som är konstant aktiv blockerade både den PKC-medierade neuritutväxten och stressfiber förlusten. Dessa resultat tyder på att den neurit-inducerande effekten av PKC involverar en inaktivering av RhoA. Våra resultat antyder att en möjlig mekanism för hur detta sker är genom att PKCε interagerar med p190RhoGAP, vilket är ett protein som inaktiverar RhoA. Cdc42 kan även påverka aktiviteten hos RhoA, och vi fann att Cdc42 är inblandad i den mekanism varigenom PKC inducerar stressfiber förlust. Både Cdc42 och Rac1 var också viktiga för utväxten av PKC-inducerade neuriter. Förutom effekten av PKC på aktin-cytoskelettet, så påverkar cytoskelettet funktionen av PKC. Den regulatoriska domänen i PKCε skiljer sig från de andra isoformerna i att den har en unik aktinbindande sekvens. Eftersom endast denna isoform ger neuritutväxt undersökte vi om denna aktinbindande region hade någon betydelse för den neurit-inducerande förmågan. Våra resultat visade att sekvensen var viktig för att proteinet ska kunna inducera neuritutväxt, troligtvist genom att reglera så att PKC har rätt form och lokalisering vid membranet.
Denna avhandling är EVENTUELLT nedladdningsbar som PDF. Kolla denna länk för att se om den går att ladda ner.