Biophysical Studies of Apolipoprotein A-IM and a Partitioning study

Detta är en avhandling från Malin Suurkuusk, Pharmacia&Upjohn, SP 19-5, SE-112 87 Stockholm, Sweden

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Kursiverade ord förklaras i ordlistan Ateroskleros (åderförkalkning) är en mycket vanlig sjukdom som börjar i tidig ålder med inlagring av bland annat kolesterol i kärlväggarna (aterosklerotiska plack). Om dessa utvecklas vidare leder det till förträngningar av blodkärlen med hjärt- och kärlsjukdomar som konsekvens. Man pratar om två sorters kolesterol; det goda (HDL) och det onda (LDL). Dessa begrepp rör inte kolesterolmolekylen i sig, utan är de partiklar (lipoproteiner) som transporterar kolesterolet i kroppen. LDL transporterar ut kolesterol till olika delar av kroppen och är det som lagras in i kärlväggarna, medan HDL transporterar kolesterolet från perifer vävnad till levern för utsöndring ut ur kroppen. HDL är en samling av olika stora komplex mellan lipider och protein. Apolipoprotein A-I (apo A-I) är den främsta proteinkomponenten i dessa komplex. Proteinet kan förekomma både lipid-bundet och i fri form. Låga halter av HDL och apo A-I i blodplasma har samband med förekomst av ateroskleros. Man tror därför att HDL har en skyddande effekt mot ateroskleros. 1980 upptäcktes en variant av apo A-I hos en familj i Italien. Denna variant kom att kallas apolipoprotein A-IMilano (apo A-IM). Apo A-IM har en aminosyra utbytt på ett sätt som gör att två proteinmolekyler kan binda till varandra; man säger att proteinet bildar en dimer. Personer med denna proteinvariant verkar vara skyddade mot ateroskleros. HDL innehållande apo A-IM istället för normalt apo A-I verkar därmed vara bättre på att transportera bort kolesterol från perifer vävnad. I vissa djurstudier har man visat att injektioner av HDL kan stoppa utvecklingen och även minska förekomsten av aterosklerotiska plack genom att ta upp inlagrat kolesterol. I och med att HDL som innehåller apo A-IM verkar effektivare än normalt HDL är det av intresse att eventuellt använda detta som medicinsk behandling av långt gången ateroskleros. Med hjälp av bakterier kan man på bioteknologisk väg producera apo A-IM, som sedan blandas med lipider för att få HDL-liknande komplex. Den första studien i denna avhandling handlar om att utvärdera olika reaktionsförhållanden för komplexbildningen. Syftet var att undersöka om man kan styra reaktionen till att ge små homogena HDL (normalt får man en blandning av olika stora HDL). Lipiden dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC), både i form av stora (MLV) och små (SUV) liposomer, blandades med apo A-IM i olika proportioner och vid olika temperaturer. Det visade sig att ett stort överskott av MLV vid 40 ºC, gav ett drygt 90-procentigt utbyte av de minsta HDL med apo A-IM. Detta kunde inte upprepas med normalt apo A-I, som gav större HDL i flera olika storlekar. Ett protein är uppbyggt av en lång kedja aminosyror som veckar och packar ihop sig på ett specifikt sätt och ger proteinet dess tredimensionella struktur. Denna struktur är viktig för funktionen av proteinet. Ett fullt veckat protein sägs vara nativt. Genom att ändra temperaturen eller sammansättningen av t.ex. salter i proteinlösningen kan man förändra eller förstöra (smälta) proteinstrukturen. Ett helt uppvecklat protein sägs vara denaturerat. Ett ämne som denaturerar proteiner kallas denatureringsmedel. Den skillnad mellan apo A-IM och normalt apo A-I som påvisats i komplexbildningen med lipider, ledde till de tre följande studierna, alla med syftet att undersöka och jämföra denatureringen av proteinerna. Detta gjordes genom att studera proteinet, dels vid temperaturförändringar och dels vid tillsats av ett denatureringsmedel. Det visade sig att apo A-IM smälte i två distinkta steg till skillnad från normalt apo A-I. Dessa två steg skedde via ett intermediärt tillstånd som varken var nativt eller denaturerat. I detta intermediära tillstånd har proteinet fortfarande en hel del av sin struktur kvar, och det kan innebära att proteinkedjan är mer flexibel än i det nativa tillståndet. Den typ av intermediärt tillstånd som observerades har tidigare setts existera för andra lipidbindande proteiner. Man tror att en ökad flexibilitetet och lösare struktur underlättar själva lipidbindningen. Intermediären existerar vid 37 ºC för apo A-IM, men inte för normalt apo A-I och skulle därmed kunna förklara en del av den skillnad i HDL- bildning som observerades vid 40 ºC. Ytterligare en studie gjordes för att utvärdera användning av modellmembran för att bestämma fördelningsjämvikter av ett ämne (läkemedel) mellan membranet och en vattenlösning. Denna jämvikt är viktig t.ex. för att kunna förutsäga om, och hur bra, ett läkemedel kommer att tas upp (absorberas) av tarmcellerna. Traditionellt brukar man få ett mått på fördelningsjämvikten genom att mäta fördelningen av läkemedlet mellan en vattenlösning och t.ex. en olja, där oljan representerar det biologiska membranet. Eftersom en olja inte kan jämställas med ett biologiskt membran av flera anledningar, är det av intresse att ta fram olika membranmodeller för att uppskatta hur ett läkemedel kommer att absorberas eller i övrigt interagera med biologiska membran. I denna studie visade det sig att modellmembranen uppförde sig olika beroende på om man använde MLV eller SUV. För att kunna använda och jämföra olika fördelningsjämvikter finns det ett behov av att standardisera membranmodellerna. Liten ordlista: Aminosyra: Byggsten för proteiner. Det finns 20 olika aminosyror som kan binda till varandra i en lång kedja och bilda proteiner. Ett protein innehåller normalt mellan 50 och 1000 aminosyror. Ordningen av aminosyrorna i proteinkedjan kallas proteinets primärstruktur. När denna kedja sedan veckar sig får proteinet sin tredimensionella struktur. Biologiska membran: Ett biologiskt membran är en barriär (vägg) mellan olika miljöer. Varje cell i kroppen är omgiven av ett membran. Även inne i cellen är de olika celldelarna omgivna av membran. Biologiska membran är uppbyggda av bl.a. lipider. I membranet kan det ingå olika proteiner. Dimer: Två sammanlänkade enheter. Monomer är en enhet, dimer är två, trimer är tre o.s.v. Dessa enheter behöver inte vara identiska. Homodimer innebär två lika enheter och heterodimer två olika enheter. Fördelningsjämvikt: Om man tillsätter ett ämne i en bägare med två i varandra olösliga faser (t.ex. olja och vatten), kommer detta ämne att lösa sig till en viss del i oljan och en viss del i vattnet. De mängder av ämnet man får i respektive fas ger fördelningsjämvikten. Lipid: Ett samlingsnamn för ämnen (t.ex. fetter) som är olösliga i vatten, men lösliga i organiska lösningsmedel. Vissa lipider är amfifila, vilket innebär att ena änden av molekylen är löslig i vatten. Dessa lipider kommer då i en vattenlösning att orientera sig så att den vattenlösliga delen exponeras för vattnet samtidigt som den skyddar den feta delen från vatten. DMPC är en amfifil lipid, med ett vattenlösligt huvud och två fettsvansar och utgör en av flera byggstenar av biologiska membran. DMPC brukar ofta användas för att göra modeller av biologiska membran. Liposomer: Strukturer uppbyggda av membranbildande lipider. MLV är uppbyggda av flera allt större sfäriska membran med vatten emellan. Dessa sfärer kan bli väldigt stora (mellan 0.1 och 10 mikrometer). SUV är ett ensamt sfäriskt membran, som är betydligt mindre än MLV (ungefär 0.025 mikrometer). Båda dessa används som modellmembran i olika studier. MLV: Se liposomer SUV: Se liposomer

  Denna avhandling är EVENTUELLT nedladdningsbar som PDF. Kolla denna länk för att se om den går att ladda ner.