A kinetic study of metabolite transfer in coupled two-enzyme reactions

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish I vår kropp står ämnesomsättningen för nedbrytning av mat till kemiska ämnen som är nödvändiga för vår energiförsörjning, kroppsuppbyggnad och fortplantning. Varje cell i varje organism tillverkar eller tar upp små molekyler, som de sedan sätter ihop till stora molekyler. Samtidigt som detta sker så bryter cellerna ner molekyler som har blivit tillverkade. Ur detta får vi ett komplicerat nätverk av metaboliska reaktioner för framställning eller nedbrytning av ämnen som behövs för förnyelse av celler och organ. Reaktionerna som har hand om den viktiga uppgiften att få celler eller multicellulära organismer att reproducera sig själva. De metaboliska reaktioner som medverkar i syntes eller nedbrytning av specifika ämnen kallas vanligtvis en metabolisk väg. En central metabolisk väg är den glykolytiska, som omvandlar glukos till pyruvat genom en serie av enzymkatalyserade reaktioner. Glykolysen sker i alla levande celler. Den förser cellen och organismen med energi både under anaeroba (= utan syre) och aeroba (= med syre) förhållanden. Glykolytiska mellanprodukter deltar i en mängd andra metaboliska vägar som har stor betydelse för ämnesomsättningen, bland annat bildande av fett samt i gröna växter koldioxid och kolhydrater. I aeroba organismer omvandlas den glykolytiska produkten pyruvat till acetyl-CoA, en viktig metabolit som går in i citronsyracykeln och därifrån länkas vidare till en mängd olika biosyntetiska processer. Gemensamt för alla metaboliska vägar är att de innehåller sekvenser av enzymkatalyserade reaktioner. Produkten från ett enzym är substrat till en eller flera på varandra följande reaktioner. Därför måste denna produkt överföras från det producerande enzymet till det konsumerande. Mekanismen bakom en sådan metabolitförflyttning är av avgörande betydelse för hur metaboliska vägar beter sig och regleras. Det finns två väsentligt olika sätt som en metabolit kan överföras mellan enzymer i metaboliska vägar. Om enzymen inte kan bilda komplex med varandra, måste metaboliten först frigöras från det producerande enzymet och sedan förflyttas till det konsumerande enzymet via reaktionslösningen genom fri diffusion. Om de två sekventiella enzymen är kapabla att bilda komplex med varandra så finns det en alternativ metabolitöverföringsmekanism som kan vara gångbar. Metaboliten kan då överföras direkt mellan det producerande enzymet och det konsumerande, utan att metaboliten frigörs ut i reaktionslösningen. Termen kanalisering har myntats för att referera till en sådan direkt metabolitöverföring. Att fastställa vilken av dessa två överföringsmekanismer som (generellt eller i enskilda fall) förekommer är av stor betydelse för vår förståelse av enzymers samverkan och metaboliska processers beteende och reglering. Denna avhandling sammanfattar fyra stycken studier som handlar om hypotesen att metaboliter kan kanaliseras i system som kan bilda bienzymkomplex. Vi har utfört några avgörande kinetiska experiment för att utröna om det finns någon skillnad i överföringsmekanismen av NADH mellan dehydrogenaser beroende av den kirala ko-enzym specificiteten hos enzymen. Vidare undersökte vi den påstådda kanaliseringen av dihydroxyacetonfosfat mellan aldolas och glycerol-3-fosfatdehydrogenas och även de isotoputspädningsdata som påstås svara mot en kanaliserad överföring av glyceraldehyd-3-fosfat mellan aldolas och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas. I våra undersökningar av de kopplade reaktionerna katalyserade av fusionsproteinen malatdehydrogenase och citratsyntas samt b-galaktosidas och galaktosdehydrogenas använde vi en ny teoretisk modell som bygger på den förväntade fria diffusionsmekanismens uppförande på fusionsproteinet då alla kinetiska egenskaper baseras på fusionsproteinet självt. Våra resultat ledde till slutsatsen att det inte finns några hållbara bevis för metabolit kanalisering i system som innehåller glykolytiska enzym. Vi fann också att kanalisering genom så kallade närhetseffekter är av försumbar betydelse.