Adipocyte phosphatases and the antilipolytic action of insulin

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Min forskning handlar om hur nedbrytningen av fett i fettceller regleras genom att fosfat tas av och sätts fast på olika proteiner inuti fettcellerna. För att man skall förstå hur fettnedbrytning hänger ihop med att fosfat reagerar med proteiner är det bra att veta något om hur fettcellernas ämnesomsättning regleras. Energilagring och fettomsättning Människokroppen lagrar energi framför allt i form av fett. Att kunna lagra fett när det är gott om mat för att sedan använda det när det när det är ont om mat har varit nödvändigt för överlevnaden, även om vi i vår del av världen numera inte behöver vara hungriga några längre perioder. När man har ett överskott av mat lagrar kroppens fettceller energi i form av fett och när man har ett underskott av mat bryter de ner det lagrade fettet för att ge energi till resten av kroppen. Vilket de skall göra regleras av flera olika mekanismer. En sådan mekanism är halten av hormonet insulin i blodet. Insulin utsöndras i blodet när vi äter och en hög insulinhalt talar om för fettcellen att det finns gott om mat och att det alltså är dags att sluta bryta ned fett. Vår forskningsgrupp har som mål att ta reda på vad som händer från det att insulinet kommer fram till fettcellen till det att fettcellen slutar bryta ned fett. Signaler i fettceller Fettnedbrytning, liksom nästan alla reaktioner i levande celler styrs av en typ av proteiner som kallas enzymer. Ett enzym katalyserar en viss kemisk reaktion och enzymets aktivitet avgör om reaktionen skall gå fort eller långsamt. För att kroppen skall kunna bestämma vad en cell skall göra är det viktigt att den kan påverka olika enzymers aktivitet så att hastigheten hos de reaktioner enzymerna katalyserar kan regleras. Ett vanligt sätt för cellerna att reglera enzymers aktivitet är genom att sätta på och ta bort fosfatgrupper från enzymet, fosforylering respektive defosforylering. Ett enzym kan till exempel vara så konstruerat att det är inaktivt när det inte är fosforylerat men blir aktivt när det fosforyleras. Processen som leder till att fettcellen slutar bryta ned fett börjar med att insulin binder till ett speciellt protein på fettcellens yta, insulinreceptorn. Insulinreceptorn går genom det membran som utgör cellens hölje, från utsidan till insidan. När insulinet binder till receptorn på utsidan av cellen förändras receptorns form på insidan av cellen. Den ändrade formen ger receptorn nya egenskaper. Därefter sker en kedjereaktion i cellen där insulinreceptorn påverkar andra proteiner, som i sin tur påverkar andra proteiner o.s.v. Bland annat sker ett flertal fosforyleringar av olika proteiner. Ett av slutresultaten är att aktiviteten hos det enzym som styr det första steget i fettnedbrytningen minskar. Defosforylering av specifika enzymer Jag har studerat defosforyleringen av två enzymer som är viktiga för regleringen av fettnedbrytning. De heter fosfodiesteras 3B (PDE3B) och proteinkinas B (PKB) och båda två är aktiva när de är fosforylerade och inaktiva när de inte är det. Båda enzymerna ligger i mitten av signalöverföringskedjan från insulin till minskad fettnedbrytning. Vid insulinstimulering av fettcellerna fosforyleras och aktiveras PKB. Det aktiverade PKB:t katalyserar sedan fosforyleringen och aktiveringen av PDE3B. Det aktiverade PDE3B:t katalyserar sedan nedbrytningen av en substans som heter cykliskt AMP och vars koncentration är avgörande för fettnedbrytningens hastighet. För att aktiviteten hos dessa båda enzymer skall kunna ökas och minskas alltefter det att cellens behov växlar måste cellen också kunna defosforylera dem igen. Den reaktionen katalyseras av enzymer som heter fosfataser. För att få veta vilka fosfataser som defosforylerar de båda enzymerna har jag använt fosfatashämmare, ämnen som specifikt blockerar aktiviteten hos en viss typ av fosfataser. Genom att behandla fettceller med fosfatshämmare med olika specificitet och sedan analysera hur PKB:s och PDE:s fosforylering påverkas av detta kan man få information om vilka fosfataser som defosforylerar dem. Resultaten från dessa experiment tyder på att både det fosfatas som defosforylerar PKB och det som defosforylerar PDE3B tillhör en speciell grupp fosfataser som kallas proteinfosfatas 2A (PP2A). Denna grupp utgörs av ett flertal olika närbesläktade enzymer. För att identifiera exakt vilka fosfataser inom PP2A-gruppen som defosforylerar PKB och PDE3B har jag renat olika fosfataser från fettceller och sedan provat deras förmåga att defosforylera de båda enzymerna. Resultaten från dessa experiment bekräftade att de tillhör PP2A -gruppen men gav inte tillräckligt mycket material för att kunna bestämma exakt vilken typ av PP2A det är. Därför har jag använt fettväv från kor för att kunna få fram så mycket PP2A att man kan göra en exakt identifiering. Eftersom både PKB och PDE3B sitter bundna till cellens membran har jag renat membranbundet PP2A från kofettet. För att få fram helt rent PP2A från detta utgångsmaterial var jag tvungna att prova ett antal olika reningsmetoder eftersom det visade sig att metoder som tidigare använts för att rena PP2A från andra vävnader inte fungerade på mitt material. Till ett antal försök kom jag fram till en reningsprocedur där jag började med ca 4 kg kofett och efter fem reningssteg och tre dagars arbete hade tillräckligt mycket helt rent PP2A för att kunna analysera det. Analysen visade att det bestod av tre proteinmolekyler som var bundna till varandra (vilket gäller majoriteten av alla fosfataser av denna typ). Det finns sammanlagt 72 kända sådana PP2A-kombinationer (2x2x18) med olika egenskaper och jag har nu fastställt exakt vilken kombination som är bunden till fettcellernas membran. Denna kunskap ger möjlighet till flera olika typer av försök i framtiden. Man kan studera hur just denna variant av PP2A är lokaliserad i fettceller (om den bara finns i vissa membran eller om den finns på andra ställen också). Man kan studera hur denna variant av PP2A defosforylerar PKB och PDE3B och man kan se om dess aktivitet påverkas av insulin eller andra hormoner. Kunskap om exakt vilken form av PP2A som defosforylerar PKB och PDE3B är också en förutsättning om man vill försöka utveckla substanser som specifikt påverkar deras defosforylering och inga andra proteiner i cellen. Tänkbara tillämpninga Diabetes är en sjukdom som drabbar allt flera. Den vanligaste typen av diabetes brukar kallas typ 2 eller åldersdiabetes. Den beror bland annat på att kroppen inte svarar normalt på det insulin som produceras. För att kunna förstå vad som gått fel och hur man skall utforma läkemedel är det viktigt att känna till alla detaljer i insulins normala verkningsmekanismer. Den sorts grundforskning som jag har gjort kan därför bli ett redskap för dem som skall utveckla läkemedel och behandlingsmetoder för patienter med åldersdiabetes. En tänkbar typ av läkemedel skulle kunna vara läkemedel som specifikt påverkar fosforyleringen och därmed aktiviteten hos ett enda enzym (t.ex. PKB eller PDE3B) och därmed på ett mycket specifikt sätt förstärker eller minskar signalen från insulin (eller något annat hormon) till ett mål i cellen.