Analysis of Complement Deficiency States. With Focus on Molecular Characterization of C4 and Properdin Deficiency

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Ärftlig brist på vissa proteiner ökar risken för autoimmun sjukdom eller svår hjärnhinneinflammation I blodbanan finns ett 30-tal olika proteiner som ingår i den del av vårt immunförsvar som kallas komplementsystemet. Detta systems huvudsakliga uppgifter är att förinta oönskade inkräktare, såsom bakterier och virus, samt eliminera skadliga proteinkomplex som cirkulerar i blodbanan. En annan viktig uppgift är att dirigera vandring och ansamling av vita blodkroppar till platser där skador uppstått. De vita blodkropparna får effektiv hjälp att förgöra inkräktarna genom att fragment av olika komplementproteiner binder till ytan hos de främmande partiklarna. Komplementproteinerna kan också samverka på ett sätt som resulterar i att inkräktarna skadas och upplöses. Komplementsystemet kan aktiveras på två olika sätt: den “klassiska” respektive den “alternativa” vägen. De främmande partiklarnas ytstruktur avgör vilken av vägarna som aktiveras. Vid aktivering samverkar komplementproteinerna på exakt samma sätt varje gång och oavsett vilken väg som startats får man samma slutresultat dvs de ovälkomna inkräktarna uppslukas eller upplöses. Vikten av ett väl fungerande komplementsystem illustreras av det faktum att personer som saknar något av de ingående proteinerna ofta drabbas av svåra bakteriella infektioner och/eller symtom som liknar den autoimmuna sjukdomen SLE (systemisk lupus erytematosus), där kroppsegna strukturer angrips. SLE är en bindvävssjukdom där praktiskt taget kroppens alla organ kan drabbas av inflammation. I denna avhandling beskrivs de metoder som vi har använt oss av för att kartlägga mutationer, d.v.s. ärftliga förändringar, som orsakar komplementbrist. Det är framför allt orsakerna till brist på komplement-protein fyra (C4) och properdin som vi studerat. Vi har också studerat vilka konsekvenser dessa genetiska förändringar medför. För att lätt kunna konstatera att en individ har komplementbrist behövs bra gallringstester. Vi har utvecklat en ny metod, som är både snabb och billig och i vilken man endast använder sig av lättillgängliga reagenser. Denna bör vara till stor hjälp när omfattande material skall undersökas. I många fall av komplementbrist kan man förebygga svåra infektioner genom vaccination. Därför är det av stor vikt att upptäcka familjer med bristindivider på ett tidigt stadium. För att kartlägga de genetiska förändringarna hos bristindividerna använde vi olika molekylärgenetiska metoder. Den mest informativa av dessa benäms sekvenering, då man undersöker sekvens för sekvens av den aktuella genen. Gener är uppbyggda av 4 olika byggstenar, sk baser, som repeteras i specifika mönster. Dessa mönster är olika för olika protein. Vid mutation har någon av baserna bytts ut, fallit bort eller nya lagts till. Dessa förändringar har oftast förödande konsekvenser, t ex att det skapas proteiner som inte är funktionella eller att inget protein alls bildas. I samarbete med en forskargrupp i Stockholm har vi här använt oss av en automatiserad sekveneringsmetod. Det är första gången som denna metod har använts för att studera en hel gen från människa, nämligen genen för komplementproteinet properdin. Komplementproteinet C4 ingår i ett enzymkomplex, som är av stor vikt för den klassiska vägens funktion. C4 finns i ett 40-tal olika varianter, vilka är specifika för varje individ. I de flesta fall har en individ 4 varianter av C4-gener, två från pappan och två från mamman. Förutom den stora genetiska variationen hos C4-gener är de också speciella i avseendet att de nedärvs i kombination med andra närliggande gener. Det gäller t ex gener för andra komplementproteiner samt gener för individspecifika vävnadstyper som är viktiga vid transplantation. En sådan specifik kombination i vilken C4-gener har fallit bort, partiell C4-brist, samt total brist på C4 har visat sig ha ett starkt samband med utvecklandet av den autoimmuna sjukdomen SLE. Fullständig avsaknad av C4 i blodet är mycket ovanligt, endast ett 20-tal individer i världen är kända. Vi har visat att vårt svenska fall med total C4-brist har haft oturen att samtliga C4-gener från både pappan och mamman var felaktiga. Denna felaktighet innebar både avsaknad av C4-gener, samt förändringar i de gener som fanns kvar. Resultatet blir att individen saknar förmågan att bilda C4-protein. Den kvarvarande genen från pappan innehåller två extra baser, vilka är orsaken till den uteblivna C4-produktionen. Denna mutation har tidigare beskrivits hos andra C4-bristindivider av en tysk forskargrupp. Dock är orsaken till att den befintliga genen från mamman inte fungerar ännu okänd. Properdin är ett positivt reglerprotein för den alternativa vägen och verkar genom att öka aktiveringen hos denna. Detta sker genom att properdin binder till ett specifikt enzymkomplex och ökar dess livslängd 10-falt. Vikten av properdinets roll i vårt försvar speglas av att personer som har en genetisk defekt i properdinfunktionen drabbas av svåra hjärnhinneinflammationer, ofta med dödlig utgång, orsakade av bakterien Neisseria meningitidis. Dessa meningokockinfektioner drabbar framför allt män, då genen är belägen på könskromosom X. Eftersom kvinnor har två X-kromosomer, medan män endast har en, så är sannolikheten oerhört liten att en kvinna skall ärva två X-kromosomer med samma defekt, vilket kan förklara varför de inte drabbas. I USA har man beräknat att män med denna defekt löper 7000 gånger högre risk att drabbas av meningokockinfektion än normala män. Det finns tre olika typer av properdinbrist; typ I med total avsaknad av properdin, typ II med endast 10% av den normala koncentrationen och den tredje formen, typ III, med normala koncentrationer av ett icke funktionsdugligt protein. En svensk familj med properdinbrist av typ I, var den som först hittades och beskrevs här i Lund i början på 80-talet. Typ III-bristen har hittills endast upptäckts i en holländsk familj. Man har totalt i världen identifierat ett 70-tal individer med properdinbrist, de flesta med typ I-brist. Vid vår sekvenering av properdingenen hos män tillhörande de olika bristtyperna fann vi ett antal olika mutationer, vilka tidigare inte varit kända. I två familjer med typ I-brist fann vi för tidiga stopp i generna. Dessa resulterar i att det bildas för korta protein. Dock kunde vi inte upptäcka dessa avkortade properdinmolekyler i de vita blodkroppar som producerar properdin. Det tyder på att dessa bryts ner direkt efter att de har bildats, vilket förklarar varför det inte går att upptäcka något properdin i blodet hos denna bristtyp. Vid typ II- och III-brist identifierades mutationer som alla gav upphov till byten av aminosyror, dvs byggstenarna i våra proteiner. Dessa byten av aminosyror resulterar i properdinmolekyler med annorlunda fysikalisk-kemiska egenskaper. I cell-kulturer från individer med properdinbrist typ II kunde vi visa att normala mängder properdin bildades och transporterades ut ur cellerna. Dock vet vi att dessa individer endast har en mycket låg halt av properdin cirkulerande i blodet, vilket tyder på en ökad nedbrytning av deras onormala properdinmolekyler. Vi kunde också visa i bindningsstudier att det icke-funktionella properdinproteinet, som individer med typ III-brist bildar, saknar förmågan att binda till det specifika enzymkomplexet i den alternativa vägen. Troligtvis är detta beroende på att aminosyrabytet har ändrat strukturen hos properdinmolekylen, varvid inbindning till komplexet förhindras. Sammanfattningsvis kan studier av genetiskt betingad variation och genetiskt betingad brist inom komplementsystemet ge viktig kunskap om vårt infektionsförsvar och uppkomsten av immunologiska sjukdomar. I relationen till autoimmunitet är C4 speciellt intressant eftersom detta protein uppvisar en stor genetisk variation kopplat till specifika vävnadstyper och dessutom samverkar med flera andra komplementproteiner. Den pågående kartläggningen av properdinbrist har gjort att vi känner till ett flertal mutationer i properdingenen. Detta har här också utnyttjats för att få ny kunskap om samband mellan struktur och funktion hos properdinmolekylen.