Mechanisms of Ischemic Brain Injury- studies in murine hippocampal slice cultures

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Stroke och hjärtstopp innebär ett minskat eller obefintligt blodflöde (ischemi) till hjärnans celler. Dessa celler är speciellt känliga för ischemi och om blodtflödet är lågt under en längre period leder det till obotliga hjärnskador. Varje år drabbas ungefär 50 000 personer i Sverige av hjärnischemi, vilket gör tillståndet till ett av de vanligaste orsakerna till handikapp och dödsfall. Om bristen på blodflöde är kortvarig skadas endast speciellt känsliga delar av hjärnan. Mekansismerna som styr känsligheten för ischemi är okända. Hippocampus, en sjöhäst-liknande struktur viktig för minneslagring, är mycket känslig för ischemi. Nervcellsdöden efter ischemi utvecklas över flera dagar och kallas därför “försenad skada”. Försenad skada är kliniskt relevant och intressant eftersom det finns ett tidsfönster för behandling innan nervcellerna dör. Skador i hippokampus efter ischemi har flitigt studerats i djurmodeller. Men trots intensiv forskning finns ännu inte några farmakologiska medel mot hjärnskada efter ischemi. För att bättre kunna studera skademekanismerna har vi utvecklar en cellkultur (in vitro) model av hjärnischemi. In vitro modeller har vissa fördelar över djur (in vivo) modeller, t ex tillgängligheten för olika behandlingar, möjligheten att studera pågående förlopp med hjälp av elektrofysiologi och mikroskopiering samt ett kontrollerat system där enskilda faktorer som jonkoncentrationer och temperatur enkelt kan varieras. En stor fördel mot in vivo modellen är också att användandet av försöksdjur minskar. Snitt av hippokampus, eller någon annan del av hjärnan, kan odlas på membran som ligger i odlingsmedium. Vävnads-snitten bibehåller sin in vivo struktur och kallas organotypiska vävnadskulturer. I de hippokampala vävnadskulturena som vi har använt behålls de neuronal kopplingarna och samspelet mellan de olika cellerna i hippocampus även i odling. Kulturerna kan leva på detta sätt i flera veckor. Syftet med den här avhandlingen var att etablera en model av in vitro ischemi som efterliknar ischemi in vivo, karaktärisera skadeutvecklingen och studera mekanismer som kan bidra till skadan efter ischemi. Kraven på modellen var att celldöden skulle vara: 1) Selektiv, dvs endast de celler som är mest känsliga i in vivo modellen skulle skadas. 2) Försenad, skadan skulle inte vara omedelbar utan utvecklas över tiden. 3) Känslig för höga glukosnivåer. Det är välkänt att höga blodglukosnivåer vid ischemi försvårar skadan. Då diabetes är en riskfaktor för stroke är detta ett reelt problem. Försöksdjur som har höga bloglukosnivåer före ischemi utvecklar mer utbredda skador. Denna skada har fram tills nu inte kunnat studeras in vitro då de tidigare publicerade in vitro modeller istället visar att närvaron av glukos under ischemi är skyddande. Vid ischemia förlorar cellerna snabbt sin energi och därmed sin förmåga att upprätthålla jongradienter över membran. Till skillnad från tidigare in vitro modeller av ischemi där ischemi-mediumet baserats på fysiologiska jonkoncentrationer, har vi valt att utgå från de K+, Ca2+ och H+-jonkoncentrationer som uppmätts i hjärnan under ischemi. Genom att höja K+ koncentrationen till 70 mM, sänka Ca2+ koncentrationen till 0.3 mM och pH till 6.5-6.8 har vi skapat en patofysiologiskt anpassad modell för in vitro ischemi. Kulturer som utsatts för 12-15 minuter av ischemi i det patofyiologiskt anpassade ischemi-mediumet uppvisar en långsammare och mindre skadeutveckling jämfört med kulturer som utsatts för ischemi i det traditionella fysiologiska mediumet. Cellskadan är begränsad till samma område som är känsligast in vivo, en del av hippocampus som kallas CA1. I det fysiologiska mediet nåddes maxskada efter 24 timmar, medan den i det patofysiologiska mediet utvecklades under 48 timmar. När glukos är närvarande under ischemi i det fysiologiska mediet är det mycket skyddande. Men om det tillsätts under ischemi i “vårt” medium ökas skadan. Den skadliga effekten av glukos är sedan länge känd in vivo, men har inte gått att visa in vitro där ischemi tidigare har jämställts med endast brist på syre och glukos. Närvaron av glukos fördröjer och ökar skadan i CA1 regionen, dessutom dör också celler i en annan del av hippocampus, i dentate gyrus. Vid ischemi frisätts stora mängder av transmittorsubstansen glutamat. När glutamat binder till receptorer på ytan av neuron öppnas kalciumkanaler och kalcium strömmar in i cellen. Kalcium sätter igång en mängd skadliga mekanismer. När dessa glutamatreceptorer blockeras minskar skadan vid in vitro ischemi (IVI), men receptorblockad har inte någon effekt på skadeutvecklingen efter hyperglykem in vitro ischemi (HG-IVI). Dvs, celldöden efter IVI är glutamatberoende, medan den HG-IVI inducerade skadan inte beror på glutamat. Detta styrker att HG IVI inducerar en cellskada som har en annan patofysiologisk bakgrund än den som ses under ischemi. I det andra går vi vidare med mekanismerna bakum ”glukostoxiciteten”. Den skadliga effekten av glukos vid ischemi är dosberoende och förutsätter acidos. Det krävs en sänkning av pH till 6.5-6.8 för att glukos skall förvärra cellskadan. Det har föreslagits att glukoseffekten beror på laktatproduktion och acidos. Men den hyperglykema effekten kan inte reproduceras av laktat och/eller acidos. Dessa resultat visar att glukos i sig är toxiskt under acidotiska förhållanden. Det är väl känt att en sänkning av hjärntemperaturen med fyra grader skyddar hjärnan mot ischemiska skador, medan en ökning av temperaturen förvärrar cellskadan. I det tredje delarbetet studeras hur skadan efter ischemi påverkas av temperaturen under ischemi, efter ischemi och kombinationen av låg eller hög under temperatur både under och efter ischemi. En sänkning respektive höjning av temperaturen under ischemi leder till en minskning respektive ökning av cellskadan i både i frånvaro och i närvaro av glukos. Däremot har temperaturen efter insulten ingen påverkan på skadeutvecklingen. Celldöd kan klassificeras in i en snabb oreglerad kollaps (nekros) eller en väl organiserad nedmontering av cellen (apoptos). Båda typer av celldöd har iakttagits efter ischemi. Mitokondrien, cellens energi-producent, deltar i den ischemiska cellskadans utveckling. Mitokondrien kan aktivera apoptos genom att släppa ut apoptos inducerande faktorer (som cytokrom c) och mediera aktiveringen av kaspas-3. Mitokondrien kan också orsaka celldöd genom att mitokondriepermeabilitets transitionsporen (MPTP) aktiveras. MPTP innebär en ökad permeabilitet av mitokondriens innermembran och leder till slut till att mitokondrien sväller och skadliga proteiner läcker ut i cellen. MPTP kan hindras med cykolsporin A. I detta arbete visar vi att skadan efter in IVI hämmas av cyklosporin A vilket tyder på att MPT aktiveras och bidrager till cellskadeutvecklingen. Däremot, påverkas inte cellskadan efter HG-IVI av cyklosporin A. Dock ses en aktivering av kaspas-3 i en del av cellerna i hippokampus och skadan i denna region minskas av kaspashämmare. I det sista arbetet studeras effekten av ischemi på en musstam där adenosin A1 receptorgenen är inaktiverad. Adenosin är en inhibitorisk neuromodulator, som minskar signaleringen mellan nervceller. Adenosin har ansetts vara skyddande vid ischemi. Men varken i en in vivo model av ischemi eller i in vitro modellen sags någon skillnad mellan möss med och utan receptors för adenosin. Det är möjligt att den uteblivna effekten beror på att kompensatoriska mekanismer har utvecklats i de moss som saknar A1 receptorn. Sammanfattningsvis beskriver avhandlingen en ny model för in vitro ischemi som uppvisar många likheter med in vivo modeller av ischemi; selektiv och försenad skada som förvärras av höga glukos nivåer. Celldöden efter ischemi och hyperglykem ischemi skiljer sig åt vad gäller tidsutveckling, omfattning och glutamatberoende.