Apoptosis induced by a human milk protein complex. Cellular and structural studies in tumour cells and bacteria

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Ett bröstmjölksprotein som dödar tumörceller Denna avhandling beskriver den tumörcell- och bakteriedödande effekten av ett proteinkomplex från bröstmjölk. Proteinkomplexet, en veckningsvariant av humant alfa-laktalbumin, inducerar apoptos (programmerad celldöd) i tumörceller och visar sig ha liknande effekter även mot bakterier. Amning förser inte bara barnet med optimal näring utan har också andra biologiska funktioner. Amning skyddar mot infektioner genom ett flertal komponenter som kan döda eller oskadliggöra bakterier och virus i luftvägarna och mag-tarmkanalen. Ammade barn löper även en lägre risk att drabbas av diabetes, inflammatoriska tarmsjukdomar, allergier och vissa typer av cancer i barndomen. Under våra studier av mjölkens anti-bakteriella effekter fann vi att mjölken även kunde döda tumörceller genom apoptos, den fysiologiska typ av celldöd som är viktig vid normala processer i kroppen där gamla eller felaktiga celler ska elimineras. Apoptos är särskilt viktig under fosterutvecklingen för att eliminera överflödiga celler och för att forma kroppens organ och extremiteter, men även i vuxen vävnad krävs reglering av cellpopulationers sammansättning. Apoptos är en aktiv process som kräver energi och som utförs på ett förutbestämt och kontrollerat sätt enligt ett nedärvt genetiskt program som finns i de flesta eukaryota celler. Apoptotiska celler har en annorlunda morfologi än nekrotiska celler. Vid apoptos minskar cellens volym, dess organeller förpackas, kärnans kromatin kondenseras och bryts ner, och cellen spricker slutligen upp i membranomslutna vesikler (apoptotiska kroppar) med cellulärt material som äts upp av närliggande celler eller professionella makrofager. Till skillnad från vid nekros aktiveras inte immunförsvaret. MAL-behandlade tumörceller uppvisade typiska apoptos-förändringar genom att cellerna minskade i volym och kromatinet kondenserades. Samtidigt inducerades den för apoptos typiska DNA fragmenteringen med högmolekylära fragment med en storlek av 50-700 kpb åtföljt av vidare nerbrytning till oligomera fragment om 200 bp. MAL dödade tumörceller, omogna och embryonala celler men hade ingen aktivitet mot friska icke-transformerade epitelceller. Lymfoida tumörceller uppvisade störst känslighet (0.25-0.5 mg/ml krävdes för att döda 50% av cellerna efter 6 timmar), medan carcinom krävde något mer protein för att dö (ca 1 mg/ml, 24 timmar). Friska epitelceller var resistenta mot apoptosinduktion av MAL. För att undersöka mekanismerna för MAL-inducerad celldöd och för att försöka förstå skillnaden mellan tumörceller och friska celler valdes två leukemicellinjer (L1210, Jurkat), ett carcinom (A549) samt friska, icke-transformerade epitelceller (HRTEC) för vidare studier. Lokaliseringsstudier visade att proteinet först binder till cellernas yta, men mängden protein på cellytan korrelerade inte till cellernas känslighet för apoptos. Däremot sågs en skillnad i upptag mellan känsliga och resistenta celler. Känsliga celler hade dels en granulär infärgning av cytoplasman, dels fick ca 70% av cellerna färgning av MAL i cellkärnan. De resistenta cellerna uppvisade bara ytbindning och inget protein kunde lokaliseras inuti cellerna. Vi analyserade sedan hur MAL i cytoplasman, respektive i kärnan kunde orsaka apoptos. Den granulära fluorescensen förklarades av att MAL band till mitokondrier i känsliga celler. Mitokondrier har nyligen visat sig spela en central roll för apoptosförloppet. Apoptosstimuli som når mitokondrierna orsakar vanligen s.k. permeability transition (PT), dvs öppnandet av megakanaler mellan mitokondriens inre och yttre membran. Detta leder till att potentialen över membranen försvinner och mitokondrien svullnar varvid yttermembranen spricker och släpper ut apoptos-inducerande faktorer. En sådan faktor är cytokrom c, som vanligtvis är involverad i elektrontransportkedjan på mitokondriens innermembran som en del av den syre-beroende ATP produktionen. Cytokrom c bildar sedan ett komplex med APAF-1 och pro-caspase-9 i cytoplasman, vilket leder till caspase-aktivering. Caspaser är en grupp cysteinproteaser som dels bryter ner molekyler som skyddar cellen mot apoptos, eller bevarar cellens form och arkitektur, dels aktiverar faktorer som krävs för utförandet av apoptosprocessen, såsom DNA-nedbrytande enzymer. MAL-behandlade celler uppvisade snabbt en minskad potential över mitokondrie-membranen följt av en frisättning av cytokrom c. Resultaten tyder på att MAL kan ha en direkt effekt på mitokondrienivå i känsliga celler. Caspas-aktivitet kunde detekteras efter 1 timme, och nådde en aktivitetstopp vid ca 2-3 timmar. Caspasernas visade sig klyva substrat inuti cellen, såsom lamin B som är ett strukturellt protein i kärnan, PARP (poly-ADP-ribose polymerase) som ansvarar för övervakning av DNA integritet samt alfa-fodrin som är en cytoplasmatisk beståndsdel i cellens cytoskelett. MAL verkade också direkt på cellkärnor. Först transporterades MAL till kärnan via aktiv nukleär transport. Därefter band MAL starkt till komponenter i kärnan men inte direkt till DNA. Dock visade sig MAL påverka DNA-integriteten på kärnnivå. MAL-behandlade isolerade kärnor uppvisade samma fragmenterings-mönster som apoptotiska celler vilket tyder på att MAL kan inducera apoptos-liknande förändringar direkt i kärnan. MAL isolerades från kasein genom jonbytarkromatografi. N-terminal sekvenering påvisade oligomera band av alfa-laktalbumin, men den nativa formen av proteinet hade ingen tumörcelldödande effekt. Jämförelser mellan den aktiva och inaktiva formen visade inga skillnader i den kovalenta strukturen, men den apoptos-inducerande formen av alfa-laktalbumin hade en annorlunda tredimensionell konformation. När-UV och fluorescence-spektroskopi visade att den aktiva fraktionen har en mer flexibel struktur och exponerar mer hydrofoba ytor, och att den liknar en känd form av proteinet, den s.k. molten globule state. Denna är en intermediär form som existerar då proteinet veckar sig och som också kan bildas vid lågt pH, i närvaro av denaturerande ämnen såsom urea och då proteinets Ca2+ jon tas bort. Den aktiva komponenten skilde sig dock i sin stabilitet från molten globule och vi har föreslagit att detta beror på proteinets inbindning av en fettsyra från mjölken. Vi har också kunnat konvertera nativt alfa-laktalbumin till den tumörinducerade formen genom att ta bort kalcium och tillsätta fettsyra som stabilisator. Den så tillverkade molekylen har vi gett namnet HAMLET, Human alpha-lactalbumin made lethal to tumour cells. MAL och HAMLET dödade också vissa bakterier, speciellt Streptococcus pneumoniae. MAL och HAMLET dödade 10^7 bakterier på 30 minuter vid en koncentration av 0.3 mg/ml. Andra streptokocker och Heamophilus influenzae, är också känsliga medan ingen effekt kunde uppvisas mot andra grampositiva (S. aureus, S. epidermidis, E. fecalis) eller gramnegativa (E. coli, M. catharralis, P. aeruginosa) bakterier. De cellulära förändringarna hos bakterierna liknade de humana apoptotiska cellerna. Bakterierna klöv sitt DNA efter MAL-behandling och till vår förvåning fann vi att fragmentstorleken var identisk med den man ser vid apoptos i tumörceller. Detta tyder på att apoptos-liknande processer kan induceras också i bakterier. Parallellen mellan effekten på tumörceller och bakterier blir speciellt intressant då man beaktar släktskapen mellan bakterier och mitokondrier. Eukaryota celler tros ha bildats genom en symbios mellan syretoleranta eubakterier och de evolutionärt äldre archeabakterierna. Det är inte otänkbart att genetiska program som styr apoptosprocessen härrör från tiden som prokaryot organism. För att testa denna hypotes undersökte vi likheter mellan mitokondrier och S. pneumoniae. MAL binder till ytan av både mitokondrier och S. pneumoniae och hos båda ses en co-lokaliering med mitokondriespecifika reagenser. Till skillnad från tumörceller så frisatte inte bakterierna cytokrom c och ingen caspase-aktivitet kunde detekteras. Detta tyder på att bakterier kan ha kvar andra äldre evolutionära mekanismer. DNA sekvensanalys av S. pneumoniae visade homologi med apoptosis-inducing factor (AIF), ett flavo-protein som finns i mitokondrien och som frisätts tillsammans med cytokrom c vid induktion av apoptos. AIF kan direkt inducera kromatinkondensering och högmolekylär DNA fragmentering i isolerade cellkärnor utan att aktivera caspaser. AIF visade sekvenshomologi med tre gener i pneumokockernas genom. En av dessa gener, NADH oxidase, var inte involverad i apoptos av bakterierna då MAL fortfarande inducerade död och DNA fragmentering i bakterier som saknar detta protein. De andra två generna kommer att undersökas framöver. Varför finns komponenter med tumörcelldödande och bakteriedödande effekter i mjölk? Epidemiologiska studier har visat att amning skyddar mot uppkomst av tumörer (speciellt lymfom) och mot infektioner. Barnets immunförsvar är inte fullt utvecklat vid födseln och barnet får därför ett tillskott av antibakteriella och immunmodulerande faktorer med moderns mjölk. Likaså är barnets mukosaytor och lymfoida system i tarmen snabbt växande vävnader, vilka kan behöva reglerande faktorer med mjölken för att undvika fel som kan leda till uppkomst av cancer eller andra sjukdomar.