Structure and Function of Beta-Mannanases from Glycoside Hydrolase Clan A. A Study of Hemicellulases from Microbes and a Mollusc

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Växter är en av den största grupperna av organismer på jorden. Den här gruppen av organismer kan syntesisera kolhydrater med solenergi. I växter används en stor del av kolhydraterna till att bilda förnyelsebara polysackarider som sedan används för att bygga upp vedstrukturer. Den mest kända växtpolysackariden är cellulosa som består av långa kedjor av glukos. Den näst mest förekommande gruppen av polysackariden i ved är hemicellulosa. Till skillnad från cellulosa kan hemicellulosa vara uppbyggd av flera typer av socker som mannos, galaktos, arabinos och xylos. De här polysackariderna namnges efter den dominerande sockertyper och får därefter namn som mannan, galaktan, arabinan och xylan. I detta arbete har den enzymatiska omsättningen av polysackariden mannan studerats. Mannan är den mest förekommande hemicellulosan i barrved och kan även förekomma i växtfrön där de fungerar som förvaringspolysackarider. Enorma mängder av cellulosa och hemicellulosa bildas årligen (1012 ton cellulosa). För att bibehålla balansen i ekosystemen krävs en kontinuerlig nedbrytning av dessa polysackarider. I denna förmultningsprocess spelar mikroorganismer en viktig roll. Kolhydrater är en universell energikälla för allt liv. Eftersom polysackarider ej kan uttnyttjas direkt i metabolismen är nedbrytning av dessa biopolymerer nödvändig för att monosackariderna ska kunna utnyttjas i cellernas metabolism. Till sin hjälp har mikroorganismerna utvecklat enzymer som kan frigöra monosackarider från cellulosa och hemicellulosa. De här enzymerna är oftast glykosidhydrolaser, dvs enzymer som hydrolyserar glykosidbindningarna i polysackarider. Dessa enzymer kan också utföra transglykosyleringsreaktioner. Dessa enzymer kan under särskilda omständigheter katalysera en syntes av nya oligosackarider (transglykosylering). I sådana fall tar en sackarid vattnets plats i hydrolysen och det bildas en ny glykosidbindning. Den här egenskapen kan potentiellt utnyttjas för att syntetisera polysackarider med nya egenskaper. Glykosidhydrolaser används idag inom industrin t.ex inom livsmedels och pappersmassa industrin. En typ av glykosidhydrolaser b-mannanaser vilka spelar en mycket viktig roll i nedbrytningen av mannan. De här enzymerna hydrolyserar de interna mannosid bindningarna i mannaner. Med lärdom av hur enzymerna fungerar är det möjligt att genetiskt modifiera dessa enzymer för att vi dels ska kunna effektivisera dem men också för att kunna utnyttja enzymerna för att modifiera hemicellulosa. Genom att strukturellt och funktionellt karakterisera enzymerna kan vi få detaljerad information om hur de fungerar i detalj. I detta arbete har sådan karakterisering utförts på tre b-mannanaser: ett bakteriellt b-mannanas (CfMan26A), ett b-mannanas från svamp (HjMan5A) samt ett b-mannanas från blåmussla (MeMan5A). Enzymerna kommer från olika miljöer, organismer och enzymfamiljer. De är också olika i deras modulära uppbyggnad. CfMan26A består av fem moduler, HjMan5A av två moduler och MeMan5A består enbart av en katalytisk modul. CfMan26A har en mannanbindande modul medan HjMan5A har en cellulosabindande modul. De här modulerna är viktiga i enzymernas generella funktion genom att de kan ankra enzymet i närhet av substratet. Valet av enzymer demonstrerar diversiteten hos b-mannanaserna. I detta arbete löstes de tredimensionalla strukturerna för CfMan26A och MeMan5A med hjälp av röntgenkristallografi. Kristallstrukturen av CfMan26A visade en tidigare okänd immunoglobulin liknande modul positionerad mellan den katalytiska och den mannan bindande modulen. MeMan5A är det första b-mannanaset från ett djur som har blivit strukturellt karakteriserat. b-mannanaser har en aktiv klyfta där hydrolysen sker. Positioneringen av polysackariden är beroende av aminosyror som utgör så kallade bindningspositioner. En eller flera aminosyror som binder samma socker utgör en position och de namnges med positiva och negativa heltal t. ex. +2, +1, -1, -2. Hydrolysen sker mellan +1 och ?1 positionerna. Genom att undersöka vilka hydrolysprodukter som bildas av oligosackariden mannotetraos kunde skillnader i bindningspositionerna observeras. Strukturell och kinetisk data användes för att utföra en partiell kartläggning av bindningpositionerna. Resultaten visade att +2 positionen hade mindre betydelse för CfMan26A jämfört mot MeMan5A och HjMan5A. Det kunde också bestämmas att CfMan26A och HjMan5A utnyttjar bindning i fem positioner för att uppnå effektiv hydrolys medan MeMan5A behöver bindning i minst sex positioner för att uppnå effektiv hydrolys. Resultaten visade dessutom att CfMan26A inte kan utföra transglykosylering. Resultaten visade att +2 bindningpositionen i HjMan5A är viktig för att kunna utföra transglykosylering. Ökad förståelse av b-mannanaser och andra glykosidhydrolaser kan hjälpa oss att designa nya enzymer som kan känna igen definierade sekvenser hos komplexa polysackarider med hög effektivitet och precision.