Tailoring of Antibody Arrays - Technical Advances Towards Global Proteome Analysis

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Populärvetenskaplig sammanfattning Personer som drabbats av cancer och autoimmuna sjukdomar ökar i vårt samhälle, vilket främst beror på förbättrade verktyg att identifiera sjukdomarna, en ökad medvetenhet, och på att vi lever allt längre. Att antalet diagnoser och även antalet överlevande ökar ställer höga krav på sjukvården samtidigt som kostnaderna ökar för samhället. Detta innebär att vården måste förbättras och bli mer effektiv för att vara hållbar i framtiden. Behovet av förbättrade diagnostiska och prognostiska metoder är stort inom sjukvården, då en tidigt fastställd diagnos och rätt behandling är livsavgörande för många patienter. Att kunna skräddarsy behandlingar för varje enskild patient efter deras förutsättningar, kallas ”Personalized medicin” och innebär ”rätt behandling till rätt person vid rätt tidpunkt”. Genom att ta reda på att ett visst biologiskt utryck medför att en patient kan förväntas svara bra på en behandlingsmetod kan patienten få en mer individanpassad behandling. På detta sätt kommer många patienter som saknar detta utryck besparas onödiga och smärtsamma ingrepp. Detta medför stora vinsterna för både patienter och samhälle, då vårdkostnaderna minskar. För att uppnå denna form av individanpassad medicin krävs så kallade biomarkörer, vilket kan vara en gen eller ett protein som är mätbart och som kan ge information om normala och sjukliga förlopp i våra kroppar. Detta kan då utnyttjas vid diagnostik, prognostik och/eller val av behandling. En bra biomarkör ska kunna svara på en klinisk fråga med hög känslighet och säkerhet och ska gärna finnas i ett lättåtkomligt provformat som t.ex. urin eller blod. Under de senaste decennierna har forskningen för att identifiera nya biomarkörer tagit ordentlig fart. Tekniker för att analysera proteiner i stor skala (proteomik) har utvecklats. Proteiner är attraktiva biomarkörer då de ger mycket information om cellerna i vår kropp. Därför behövs tekniker för att mäta proteiner. Flera tekniker använder sig av antikroppar, vilket är proteiner som ingår i vårt immunsystem. De har förmågan att skydda oss mot för kroppen främmande ämnen. En antikropps gen består av ett flertal gensegment som kan kombineras ihop på ett nästan oändligt antal olika sätt, vilket bidrar till en enormt stor genetisk variation bland de antikroppar som bildas i vår kropp. Antikroppar kan binda specifikt till yt-molekyler (antigen) på smittoämnet och ger då andra celler i immunförsvaret förmågan att eliminera ämnet från kroppen. Antikropparnas förmåga att binda starkt och specifikt till olika molekyler gör dem unika, vilket kan utnyttjas i många olika tekniska applikationer. En sådan applikation är antikroppsmikromatriser (antibody microarrays) eller antikroppschip. I vår forskargrupp använder vi oss av syntetiska antikroppar för att mäta nivån av olika proteiner i kliniska prover. Antikropparna kommer från ett antikroppsbibliotek, som skapats på syntetisk väg och som härmar immunförsvarets förmåga att kombinera antikroppens olika gener. Biblioteket innehåller flera miljarder unika antikroppar som alla har samma ramstruktur, det som skiljer dem åt är att varje antikropp har en unik kombination CDR-loopar (utgör specificiteten), som avgör vilket antigen som antikroppen binder. Antikroppar, med en önskad specificitet, kan plockas ut ur biblioteket och produceras därefter i bakterier. Eftersom antikropparna är gjorda på syntetisk väg så lämpar de sig för nya molekylära designer. Tekniken som utvecklats i vår grupp bygger på att en robot placerar ut (dispenserar) de syntetiska antikropparna i mycket små volymer (spots) i ett bestämt mönster, på ett plast eller glaschip. Proteinerna som finns i de kliniska proverna som analyseras på chipet kommer specifikt att fångas upp av antikropparna på chipet och kan detekteras med en laserscanner. Genom att identifiera skillnader i proteinuttryck hos t.ex. friska- respektive sjuka individer kan ”proteinkartor” byggas för olika sjukdomar och i förlängningen kan de användas som biomarkörer för att ställa diagnos, prognos, välja behandlingsform i framtiden. Fram tills idag har antikroppschip bestående av ≤ 2,000 antikroppsspots/cm2 tillverkats vilket ger en spotdiameter på ~150 μm. Dessutom har forskare lyckats sätta ner ~800 olika antikroppar på ytan, men då det mänskliga genomet består av över 20,000 proteinkodande gener består proteomet till största sannolikhet av flera hundra tusen olika proteiner. Detta kräver nya miniatyriserade chip där fler antikroppar kan ingå i analysen. Att öka antalet olika antikroppar på chipen kommer dock att generera stora logistiska problem när det kommer till upprening och dispensering av antikropparna, vilket är både kostsamt och tidskrävande. Immobiliseringen (sättet antikropparna fästs på ytan) av antikroppar kräver därför bättre tekniska lösningar, som t.ex. att icke upprenade antikroppar med specifika adresslappar själva skulle hitta sin hemadress på chipet, ”självadressing”. I denna doktorsavhandling har jag utvecklat nya metoder för att tillverka nästa generations miniatyriserade antikroppschip i sökandet efter nya biomarkörer. Mitt arbete presenteras i fyra artiklar, och har varit indelat i två delar. Den första delen har handlat om att utveckla miniatyriserade arrayer, på så sätt kan antalet spots ökas på chipet (artikel I-III). Den andra delen av arbetet har handlat om att ta fram antikroppar med en ny ljusreaktiv egenskap, för att underlätta logistiken vid framrening och immobilisering av antikropparna på chipytan (artikel IV). I artikel I och artikel II användes ett robotverktyg baserat på en teknik som kallas dip pen nanolitography (DPN). Roboten satte ner antikroppsvolymer som gav 78.5 µm2 stora spots (diameter 10µm), vilket var en storleksreducering med 225 gånger jämfört med vår vanliga plattform, detta i sin tur ger en spot densitet på 38,000 spots/cm2. I artikel I tillverkades chip där 12 olika antikroppar sattes ner på chipet samtidigt. Här kunde vi visa att den nya plattformen var känslig nog att användas för proteinanalys. I nästa steg, artikel II utvecklades tekniken vidare och miniatyriserade chip bestående av 48 olika antikroppar tillverkades. I denna applikationsstudie analyserade vi serumprover från patienter som drabbats av den autoimmuna sjukdomen systemisk lupus erythmatosus (SLE) och friska individer. Resultaten visade att plattformen kunde identifiera proteiner som visat sig vara relevanta biomarkörer i för en av de allvarligaste formerna av SLE (SLE-neftrit). I artikel III användes ett robot verktyg baserat på kisel cantilever (en hävarm, förankrad i endast en ände), och chip bestående av 16 olika antikroppar producerades, och resultaten visade att plattformen hade tillräcklig god prestanda för att analysera kliniska prover. Även denna robot kunde sätta ner antikroppsvolymer som gav 78.5 µm2 stora spots. I artikel IV har arbetet varit fokuserat på utveckling av antikropparna som används på chipen. I den här konceptstudien har en icke naturlig aminosyra introducerats i antikroppens ramstruktur. Aminosyran kan användas som handtag och kopplas ihop med en kemisk molekyl i närvaro av ultraviolettljus. Resultaten för antikroppen ser lovande ut och i framtiden skulle vi vilja använda handtaget för att kunna sätta ner (självadressera) icke upprenade antikropparna på chipytan med hjälp av enkel strängat DNA. Sammanfattningsvis har jag i denna avhandling designat och optimerat nya metoder för att tillverka miniatyriserade antikroppschip, genom att fokusera på både miniatyrisering och immobilisering av antikroppar för storskalig proteinanalys av kliniska prover. I framtiden skulle detta kunna leda till att fler biomarkörer identifieras för bättre diagnostik, prognostik och val av behandlingar för olika cancer- och autoimmuna sjukdomar.