Vacuolar Ca2+-ATPases in Plants. Regulation by calmodulin binding to a N-terminal autoinhibitory domain

Detta är en avhandling från Maivi Åkesson, Dept. of Plant Biochemistry, Lund University, P.O. Box 117, 22100 Lund, Sweden

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Kalcium är ett livsviktigt ämne för både djur och växter. Kalcium behövs t.ex. för uppbyggnaden av skelettet, för att hjärtat skall slå och för att musklerna skall dras samman. I växter är kalcium en viktig beståndsdel i cellväggarna och behövs också vid bl.a. celldelning. Trots detta måste koncentrationen av fria kalciumjoner inne i cellen (i cellvätskan) hållas mycket låg, eftersom för hög koncentration av fritt kalcium är skadlig för cellen. Detta beror till stor del på att kalciumjonerna då reagerar med den fosfat som finns i cellen och som är livsnödvändig för cellens ämnesomsättning. Den bildade kalciumfosfaten är olöslig och kan därför inte användas av cellen. Tack vare sin låga koncentration kan kalciumjonerna användas som budbärare vid överföring av en mängd olika signaler i cellen. Vid signalöverföringen höjs kalciumkoncentrationen tillfälligt, men den måste sedan sänkas till normalnivå. För att reglera kalciumkoncentration inne i cellen har ett antal proteiner utvecklats vars funktion är att transportera bort kalciumjonerna från cellvätskan. Kalciumjonerna kan antingen transporteras ut från cellen eller in i s.k. organeller som finns inne i cellen. Största delen av växtcellen fylls upp av en organell som kallas vakuol och som är en viktig upplagringsplats för kalcium i växtceller. Liksom andra organeller omsluts vakuolen av en tunn hinna (membran) i vilken sitter olika proteiner, bland annat kalciumpumpar (kalcium-ATPaser). Koncentrationen av kalcium utanför cellen eller inne i organellerna är 1000 — 10000 gånger högre än i cellvätskan. Transporten av kalcium från cellvätskan sker således mot en stor koncentrationsgradient och är energikrävande. Energin tas från spjälkning av den energirika föreningen ATP och kopplas till transporten av kalcium genom membranet, därav namnet kalcium-ATPas. ATP är en som används av cellen i många olika sammanhang. Figur 2, sid. 19, visar en cell med de kalciumtransporterande proteiner man känner till i dag. Jag har arbetat med kloning och karakterisering av ett kalcium-ATPas i blomkål kallat BCA1 (för Brassica oleracea Ca2+-ATPase 1). Det var sedan förut känt att kalciumtransporten hos detta protein stimulerades av ett annat mindre och lösligt kalciumbindande protein, calmodulin. BCA1 kunde också renframställas genom selektiv inbindning till calmodulin. Det renade proteinet kunde klyvas med ett proteas (ett enzym som klipper upp aminosyra-kedjan på vissa bestämda ställen) och aminosyra-sekvensen kunde bestämmas för en del peptider. Detta förfaringssätt låg till grund för kloningen av hela genen (artikel I): d.v.s. att rena den del av blomkåls-DNAt som kodar för BCA1 och att göra många kopior av BCA1-sekvensen. När man väl känner till DNA-sekvensen kan man översätta den till motsvarande aminosyrasekvens. BCA1 består av 1025 aminosyror av vilka de flesta vetter mot cellvätskan, d.v.s. den del av cellen där kalciumkoncentrationen måste hållas låg (se figur 6, sid. 41). Sekvensanalys antydde att det fanns en calmodulinbindande del alldeles i början (i den s.k. N-terminalen) av BCA1, vilket var något nytt. Liknande enzymer i djurceller har nämligen sin calmodulinbindande del alldeles i slutet av proteinet. Detta tydde på att kalcium-ATPaser i växter fungerar på ett lite annorlunda sätt än de gör i djur. Vi har fortsatt arbetet med karakterisering av BCA1 (artikel II). Både biokemiska studier och undersökning i mikroskop visar att BCA1 finns i vakuolmembranet. Vi kunde visa att N-terminalen binder calmodulin på ett kalciumberoende sätt. Bortklyvning av N-terminalen aktiverar också enzymet och resulterar i att den calmodulinbindande delen då försvinner. Detta tyder på att N-terminalen även har en hämmande funktion. En peptid motsvarande den calmodulinbindande delen hämmade kalcium-transporten. Vi har vidare studerat reglering där en fosfatgrupp binder in till vissa aminosyror på proteinet, s.k. fosforylering, vilken är en mycket vanlig regleringsmekanism för många enzymer. Sammantaget visar resultaten att N-terminalen har en viktig, reglerande funktion hos BCA1. Detta stöds av andra forskargrupper, då det har visat sig att alla hittills kända calmodulinstimulerade kalcium-ATPaser i växter har en lång N-terminal innehållande den calmodulinbindande sekvensen. Det är för närvarande inte känt hur denna skillnad mot djur har uppkommit eller om det har någon fysiologisk betydelse. Jag har dessutom arbetat tillsammans med en grupp i Köpenhamn. Där studerades ett kalcium-ATPas i en annan växt, Arabidopsis thaliana (backtrav; artikel III). Detta kalcium-ATPas, ACA4, kunde klonas genom att man letade i databasen efter sekvenser vilka liknade BCA1. Jag gjorde här främst växtfysiologiska försök på genmodifierad Arabidopsis som hade tillförts en extra DNA-sekvens kodande för en aktiv form av ACA4. Jag undersökte då dessa växters förmåga att växa i närvaro av höga halter NaCl (koksalt) och jämförde med omodifierade växter. Det visade sig att de växter som hade mer av aktivt ACA4 kunde växa bättre i närvaro av förhöjd saltkoncentration än de som inte hade detta aktiva ACA4. Det kan tyda på att ACA4 är viktigt i växtens försvarsmekanism mot saltstress. Arabidopsis kallas ibland "växtforskarnas bananfluga" och används mycket på grund av sitt lilla genom (totala DNA-innehåll), sin snabba tillväxt och korta livscykel. I likhet med det mer kända HUGO-projektet för kartläggning av det mänskliga genomet, finns det ett internationellt projekt för att kartlägga och sekvensera hela Arabidopsis-genomet. Det projektet är snart färdigt, och hittills har man identifierat 11 olika kalcium-ATPas gener att jämföras med sju kända kalcium-ATPas gener i människa. Man vet inte varför växter har så många olika kalcium-ATPaser, och att ta reda på detta blir en spännande uppgift för framtida studier!

  Denna avhandling är EVENTUELLT nedladdningsbar som PDF. Kolla denna länk för att se om den går att ladda ner.