FROM SERUM TO TISSUE: GALECTIN-BINDING GLYCOFORMS OF SERUM GLYCOPROTEINS AS FUNCTIONAL BIOMARKERS

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Cellerna i kroppen är uppbyggda av fyra olika byggstenar: DNA, proteiner, fetter samt kolhydrater. Kolhydrater förknippas framförallt med energi och det pågår en intensiv debatt om kolhydraternas vara eller icke vara i vår kost. Kolhydraterna har dock också en helt annan funktion, en som är obestridligt oumbärlig för alla levande organismer. I denna roll förekommer de bland annat som en extra tillsatt del på proteiner och fetter och bildar på så vis så kallade glykoproteiner och glykolipider. Dessa finns på ytan av kroppens alla celler och utgör en stor del av de molekyler som finns i vårt blod. Här har kolhydraterna, eller glykanerna som de kallas, en reglerande funktion genom att forma en sorts nedskriven kod på dessa molekyler som informerar omgivningen om vad som skall hända med dem. Avläsningen av denna kod görs av kolhydratsbindande proteiner som kallas lektiner, som finns i vår kropp men även hos infekterande bakterier och virus. Olika lektiner känner igen olika kolhydratsstrukturer och kan på så vis sortera ut specifika glykoproteiner eller glykolipider. Bland annat använder sig flera virus av lektiner för att ta sig in i kroppen och det faktum att en femtedel av befolkningen är immuna mot vinterkräksjukan beror på att dessa saknar den kolhydratsstruktur som viruset använder sig av för att ta sig in i vävnaden. Samspelet mellan glykoproteiner och lektiner är även av stor vikt för flera cellulära processer i kroppen. En cell kan ändra vilka kolhydrater den sätter på sina proteiner beroende på hur den mår och vad den vill utföra. Detta är väldigt uppenbart i cancer då tumörceller börjar producera andra kolhydrater än vad de normalt gör, t. ex för att växa snabbare. En specifik lektinfamilj är galektinerna som binder till glykoproteiner som bär kolhydrater innehållande galaktos. Genom att binda till dessa kolhydrater, får galektiner en reglerande roll i immunförsvaret, inflammation och cancer. Galektiners bindningsstyrka för ett visst glykoprotein, och därpå följande biologiska effekt, styrs inte bara av förekomsten av galaktos, utan även av angränsande kolhydratsstrukturer och proteindelar, det vi kallar galektinernas finspecificitet. Denna avhandling ställer tre frågor baserade på detta: vad är mekanismen för denna finspecificitet (arbete I och II)? Hur är den kopplad till biologisk funktion (arbete I,II och V)? Hur är den kopplad till sjukdom (arbete II och III)? För att få en djupare förståelse för hur galektinernas finspecificitet fungerar har vi först bytt ut (muterat) vissa aminosyror (byggstenarna i proteiner) som bygger upp den kolhydratbindande domänen, och bildat så kallade mutanter av det ursprungliga galektinet. Sedan har vi mätt hur dessa mutationer påverkar bindingen till olika kolhydratstrukturer och glykoproteiner. Genom att mutera galektin-3, kunde vi förbättra bindingen till en del kolhydratstrukturer och försämra den till andra. Genom att sedan testa dessa i ett biologiskt system kunde vi fastställa vilka delar av finspecificiteten som är viktiga för galektinets funktion, vilket i framtiden kan vara en av startpunkterna för utvecklandet av läkemedel som har galektiner som måltavla för sin effekt. För att förstå vad som händer i celler när ett galektin binder ett glykoprotein separerade vi först två av de vanligast förekommande glykoproteinerna i blod, transferrin och haptoglobin, baserat på om de binder till galektiner eller inte. En mindre del (5%) av transferrinet band till galektin-3 och genom att märka in denna fraktion med fluorescerande färg, och studera dess upptag i celler med mikroskop, kunde vi se att denna galektinbindande fraktion styrdes till andra delar inne i cellen jämfört med den som inte band. I celler som saknar galektin-3 transporteras de båda fraktionerna likadant, men om galektin-3 tillsätts utifrån får man skillnad i transporten. Med andra ord styr galektin-3 hur transferrin ska transporteras i cellen. Transferrin försörjer alla celler i kroppen med järn, en livsviktig funktion, och hur transferrinet rör sig inne i cellen är grundligt studerat. Likväl har ingen studerat hur kolhydraterna på transferrinet påverkar denna process, vilket gör vår upptäckt mycket intressant. Vidare visar det på en biologisk funktion för galektinernas finspecificitet: att välja ut en undergrupp av ett glykoprotein och styra det annorlunda inne i cellen. En tredjedel av allt haptoglobin som en frisk person har i blodet binder till galektin-1. För att förstå vad detta har för biologisk konsekvens, använde vi oss av samma modell som ovan. Precis som för transferrin styrdes det haptoglobin som band till galektin-1 annorlunda jämfört med det som inte band. Det förefaller som att galektin-1-bindande haptoglobin undviker de delar av cellen som sköter nedbrytning och istället återcirkulerar ut ur cellen igen. Som tidigare nämnts brukar sjukdomar, som exempelvis cancer, medföra att celler producerar glykoproteiner med annorlunda kolhydrater. När vi istället studerade haptoglobin hos patienter med långt framskriden bröstcancer såg vi att mer än hälften band till galektin-1, d.v.s. vi såg en ökning med närmare tjugo procentenheter jämfört med friska individer. Denna förändring skulle betyda att en mindre del haptoglobin bryts ner i cancer än hos friska, vilket i sin tur kan vara fördelaktigt för cancern då haptoglobin har visat sig vara viktig för att tumörer skall kunna växa. Av den stora mängd studier som gjorts på galektiner har de flesta en koppling till sjukdomstillstånd som inflammation och cancer. Rollen av galektinernas finspecificitet i detta är relativt okänd, men troligen är den kopplad till de förändringar av kolhydratsstrukturer som förknippas med sjukdom. Ett sätt att studera detta är att analysera vilka glykoproteiner, och hur mycket av dessa, som binder till galektiner i blod från sjuka patienter och jämföra med friska. Bland annat så har vi studerat galektin-8s bindning till glykoproteiner i blodet hos en stor mängd patienter (100 st) med en inflammatorisk njursjukdom kallad IgA nefrit. Vi fann att en kolhydratförändring hos en antikropp resulterade i minskad bindning till galektin-8. Denna förändring är tidigare känd men har aldrig kopplats till ett galektin. Dessutom fann vi en förändrad bindning till andra proteiner, vilket innebär att det måste ske en förändring av kolhydratstrukturerna även på dessa, vilket är ett helt nytt fynd. Varje år dör uppskattningsvis sju miljoner människor i cancer och antalet ökar för varje år även om medicineringen har förbättrats. Tidig upptäckt är kanske det bästa redskapet för att bekämpa cancer men för detta krävs enkla test som kan separera frisk från sjuk långt innan tumören har hunnit spridas. Enklast vore om man i ett simpelt blodprov kunde hitta markörer som kunde tala om detta. Dessa så kallade biomarkörer är kraftfulla verktyg för screening, diagnos och prognos samt utvärdering av olika behandlingar. Svårigheten att få fram en förstklassig biomarkör ligger i att hitta en som är känslig nog att fånga upp alla som är sjuka, utan, att av misstag, plocka ut några friska i denna process. Detta är ett stort problem för PSA-provet som idag används för att testa män för prostatacancer, och anses därför inte vara tillräcklig bra för screening i vissa länder. Att utnyttja förändringar av kolhydratstrukturer för tidig upptäckt av cancer har alla förutsättningar för att bli en ny generation biomarkörer. Som tidigare nämnt ser vi en betydande ökning av galektin-1-bindande haptoglobin hos patienter med bröstcancer. Trots att detta är baserat på begränsat antal patienter, är ökningen i galektin-1- bindande haptoglobin statistiskt säkerställd, och är en lika bra biomarkör som många av de som används idag. Även galektin-8 band haptoglobin, men intressant nog inte samma fraktion som galektin-1. Dessutom band galektin-8 mindre mängd haptoglobin hos cancerpatienterna än hos friska. Troligen känner dessa två galektiner igen helt olika kolhydratsstrukturer på haptoglobin. Ökningen av galektin-1 bindande haptoglobin är en bra biomarkör i sig, men genom att kombinera den med minskningen av galektin-8-bindande haptoglobin, d.v.s. ta kvoten av dessa, får man en biomarkör som är överlägsen de som används idag. Även om detta är preliminära resultat, och fler studier behövs, så finns det en god chans att galektiner kan användas för att hitta biomarkörer för tidig upptäckt av cancer. Förutom att de verkar vara känsliga nog för att urskilja sjuka individer i en större population, specifika nog för att med stor säkerhet kunna skilja sjuk från frisk och med en provtagning som innebär så lite lidande för patienten som möjligt har vi visat att de dessutom är kopplade till en biologisk funktion. Dessa, så kallade funktionella biomarkörer, kan förutom att upptäcka och följa sjukdomen, även användas som måltavlor för behandling av sjukdomen.