RECOMBINANT PEROXIDASES AND XYLANASES: I. Cloning and production of a peroxidase from horseradish II. Characterisation of functional domains of thermostable xylanases from Rhodothermus marinus

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Till alla de som har undrat vad det är som jag har hållit på med under alla dessa år men inte vågat att fråga. Jag har arbetat med kloning av gener som kodar för olika enzymer. Enzymer finns i alla levande celler och fungerar som katalysatorer (hjälpare) i olika biokemiska reaktioner. Deras uppgift är att påskynda reaktionshastigheten utan att själva förbrukas i reaktionen och alla enzymer har sin speciella funktion i cellen. Varje enzym motsvaras av en gen, del av arvsmassan, som utgör själva ”ritningen” för det enzym som det kodar för. Förutom att enzymer uppfyller sina naturliga uppgifter i cellen kan de också vara intressanta för användning i olika analytiska och industriella processer. Man kan rena fram enzymer från cellerna för att sedan använda dem som tillsatser i tvättmedel, pappersblekning m.m.. Oftast behövs det stora mängder av enzymet och ibland ställs det höga krav på att de är rena, krav som ibland kan vara svåra att uppfylla. Då kan det vara en fördel att klona genen för det aktuella enzymet och låta en högproducerande mikroorganism ta hand om tillverkningen. Det blir då också lättare att rena upp enzymet. Kloning innebär att man ”klipper ut” den aktuella genen från den ursprungliga värden, flyttar över den i en ny värdorganism och låter denna att massproducera det främmande enzymet. Den mest använda organismen för sådana ändamål är en ”laboratoriesläkting” till den vanliga tarmbakterien Escherichia coli, den klassiska ”arbetshästen”, som har förmågan att föröka sig i mycket snabb takt och producera stora mängder av det främmande enzymet. De enzymer som jag har arbetat med är peroxidas respektive xylanas. Det är två helt olika enzymer med helt olika ursprung. Peroxidaser finns i alla levande celler och det peroxidas som jag har arbetat med kommer från pepparrot. Pepparrotsperoxidasets naturliga funktion är bl.a. att ingå i växtens försvar mot parasitangrepp och andra sorters stress så som kyla, luftföroreningar, m.m. Man vet också att de deltar i regleringen av växtens tillväxt. Peroxidaser används idag i en mängd olika kliniska och industriella sammanhang. De ingår t. ex. i de s.k. ”glukosstickor” som används av bl.a. diabetiker för att mäta socker i urinen. När det finns socker så ändrar stickan färg, ju mer socker desto större färgomslag. Min uppgift har varit att isolera genen för peroxidas från pepparrot och sedan hitta en lämplig värdorganism för att kunna producera peroxidaset i stor skala. Jag lyckades att isolera en gen som kodar för ett peroxidas som skiljer sig något från det vanligen använda peroxidaset med avseende på dess aminosyrasammansättning, d.v.s. de ingående byggstenarna. Jag provade att producera enzymet i den klassiska arbetshästen Escherichia coli men enzymet visade sig vara giftigt för bakterien. Det system som har visat sig vara bäst lämpat för produktion av ”mitt” peroxidas bygger på kloning och produktion i insektsceller. Vi har fått resultat som tyder på att det nya peroxidaset har något annorlunda egenskaper än det vanligen använda peroxidaset. I dag finns det ett stort intresse för att utveckla nya peroxidasbaserade mätmetoder och processer och det nya peroxidaset borde vara en intressant kandidat för sådana ändamål. Xylanas är det andra enzymet som jag har arbetat med. Xylanaser bryter ner xylan som finns i ved. Xylanaser har visat sig intressanta i pappersblekningssammanhang där de utgör ett miljövänligt alternativ till det giftiga kloret. Ved består i huvudsak av cellulosa, olika hemicellulosor, bl.a. xylan, och lignin. Det är ligninet som gör att oblekt papper är brunt. Det mesta av ligninet försvinner vid kokning av pappersmassan men för att få vitt papper av hög kvalitet måste det resterande ligninet tas bort med olika blekningsmetoder. Klorgas är den effektivaste kemikalien men också den giftigaste. Andra kemikalier som också kan användas är klordioxid, syrgas, ozon och väteperoxid. Om man förbehandlare massan med xylanaser kan mera av ligninet tvättas bort och mängden klor i blekningsprocessen kan minskas eller helt tas bort. Efter kokningen är temperaturen hög i pappersmassan och ”vanliga” enzymer förstörs. Det är därför en stor fördel att använda värmestabila enzymer. Termofila (värmeälskande) bakterier producerar värmestabila enzymer. Xylanaset som jag har arbetat med produceras naturligt av en termofil bakterie som heter Rhodothermus marinus och som lever i marina varma källor. Just den här bakterien isolerades från en varm källa strax utanför Islands nordvästra kust. Nackdelen med Rhodothermus marinus är att den producera xylanas i alldeles för låga mängder. Vi har därför klippt ut och fört över genen som kodar för xylanas från Rhodothermus marinus till Escherichia coli och låtit den producera xylanaset i stora mängder. Enzymer som xylanaser, som har till uppgift att bryta ner stora polymerer (som xylan) till små beståndsdelar är oftast uppbyggda av flera olika delar, s.k. domäner. Dessa domäner har specifika funktioner. Vi har funnit att vårt xylanas består bl.a. av en katalytisk domän vars uppgift är att sköta själva nedbrytningen och en bindande domän som hjälper till att förankra enzymet vid polymeren och på så sätt göra nedbrytningen effektivare. Min uppgift i det här projektet har varit att klona dessa bindande domäner och studera deras bindningsegenskaper. Meningen är att vi skall se om de bindande domänerna kan göra nedbrytningen av xylan effektivare när man bleker papper.