Tryptophan-related Neurotransmission in the Brain: Disturbances Associated with Experimental Hepatic Encephalopathy

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Tryptofan (TRP) är en s.k. essentiell aminosyra d.v.s. den kan inte syntetiseras av kroppen utan måste intas med födan. TRP ingår bl.a. som byggsten i kroppens proteiner men TRP används även som substrat för bildningen av signalsubstansen serotonin (även kallad 5-hydroxytryptamin; 5-HT). Dessutom kan TRP användas för bildningen av de för kroppen livsviktiga molekylerna NAD och NADP vilka har betydelse for kroppens ämnes- och energiomsättning. Under bildningen av NAD och NADP bildas bl.a. substansen kinolinsyra (QUIN) vilken verkar som stimulant (agonist) av NMDA-klassen av glutamatreceptorer och QUIN kan därför tjäna som en endogen nervstimularande substans. Leverencefalopati (LE) är en neuropsykiatrisk sjukdomsbild som ofta ses i samband med sviktande leverfunktion. Den vanligaste typen av LE utgörs av den kroniska formen, ofta kallad portal-systemisk encefalopati (PSE) p.g.a. att graden av förbiledning av portåderns blod runt levervävnaden tycks vara den faktor som bäst korrelerar med graden av störningar i hjärnans funktion(er). Bakgrundsorsaken till PSE är inte sällan kroniskt alkoholmissbruk med skrumplever-utveckling, men ibland uppkommer även PSE efter olika typer av t.ex. kroniska hepatiter eller kirurgiska ingrepp i leverblodcirkulationen eller levervävnaden. Vi saknar idag effektiv behandling av PSE och klargörandet av de störningar som föreligger i hjärnan vid kronisk PSE utgör en förutsättning för rationell utveckling av läkemedel och andra terapier mot detta tillstånd. Bildningen och nedbrytningen av 5-HT i hjärnan har tidigare visat sig vara kraftigt förhöjd vid experimentell PSE. Om den neuronala frisättningen av 5-HT i hjärnan och därmed 5-HT funktionen i stort också är förändrad vid detta tillstånd är dock okänt. Dessutom har halterna av QUIN hävdats vara ökade i hjärnan vid PSE och QUIN har därför föreslagits att spela en viktig roll för utvecklan-det av detta syndrom. Avsikten med denna avhandling har varit att studera TRP-relaterad signalöverföring i hjärnan och eventuella störningar i denna överföring vid experimentell PSE. Främst har den föreslagna QUIN-hypotesen för uppkomst av PSE (delarbete I och II) samt eventuella störningar i frisättningen av bl.a. 5-HT i hjärnan vid detta tillstånd studerats genom en rad olika försöksuppläggningar (III till VIII). För att experimentellt studera PSE användes en djurmodell bestående av en kronisk ända-till-sida s.k. portacaval shunt (PCS) på råtta. Detta innebär att råttans portåder delas upp och sys ihop med nedre hålvenen så att blodet från mag-tarmkanalen, som normalt går via levern för ämnesomsätt-ning innan det når den systemiska blodcirkulationen, nu istället går icke ämnesomsatt direkt ut i kroppens övriga blodcirkulation. Redan efter en kort tid uppvisar dessa PCS råttor symptom på utvecklandet av dels leversvikt (ses bl.a. som minskad kroppsvikt samt lever/kroppsvikts-kvot) men dels även av en typisk encefalopati (ses som karakteristiska beteendestörningar på råttan). Frisättningen av QUIN och 5-HT i hjärnan studerades med hjälp av s.k. in vivo hjärnmikrodialysisteknik. Denna teknik innebär att en särskild sond, en s.k. probe, med ett semipermeabelt membran implanteras i aktuell hjärnregion. Därefter genomsköljs (perfunderas) proben med en konstgjord cerebrospinalvätska varvid ämnen under en viss storlek, framför allt p.g.a. koncentrationsskillnader, diffunderar över membranet antingen ifrån perfusionslösningen och ut i hjärnan eller vice versa. Mikrodialysvätskan tas därefter om hand och analyseras med hjälp av sofistikerade kemiskt analytiska tekniker med stor känslighet för dess innehåll av bl.a. QUIN eller 5-HT. Resultaten från delarbete I och II visade inte på någon ökning av QUIN vare sig perifert i blod eller i hjärnvävnad hos PCS råttorna vid jämförelse med sham-opererade kontroller utan snarare på en generell minskning vid experimentell PSE jämfört med normalt. Inte heller efter provokation av kronisk PSE till koma genom tillförsel av ammoniak till PCS råttor talade resultaten för att föränd-ringar i hjärnans QUIN-innehåll kan vara orsak till PSE. För att utesluta att relativt små ökningar av den funktionellt aktiva extracellulära halten QUIN i hjärnan trots allt skulle kunna bidra till utveck-landet av PSE studerades i delarbete II de extracellulära QUIN halterna i hjärnan med eller utan exogen tillförsel av TRP. Ej heller detta projekt kunde belägga någon ökning av extracellulärt tillgängligt QUIN i hjärnan vid experimentell kronisk LE. Med stöd av dessa resultat drar vi slut-satsen att QUIN med största sannolikhet inte spelar någon större direkt roll för uppkomsten av vare sig kronisk eller akut PSE. Därmed kan en viktig hypotes som inom forskningsfältet sedan 10 år ej kunnat vederläggas nu förhoppningsvis förkastas. I delarbete III såg vi i mikrodialysat från hjärnbarken hos råttor med akut LE bl.a. en 600% ökning av halten TRP jämfört med friska kontroller. Frisättningen av 5-HT från hjärnbarken visade sig dock vara kraftigt minskad (upp till 90%) vid akut LE jämfört med normalt. Vid subakut och kronisk LE sågs inte någon skillnad av denna 5-HT frisättning jämfört med kontroller. Det är idag därför oklart om den tidigare allmänt hävdade 5-HT förändringen i hjärnan vid LE har något funktionellt samband med en ökad serotonerg aktivitet i CNS vid dessa sjukdomstillstånd. För att utröna prekursoraminosyran TRP´s eventuella effekter att påverka 5-HT frisättningen genomfördes i delarbete IV mätningar av extracellulära 5-HT koncentrationer från frontala hjärnbarken hos PCS råttor efter injektion i buken (intraperitoneal injektion; i.p.) av TRP i en dos och därefter upprepat till jämvikt (laddningsdos om 280 mg/kg kroppsvikt följd av upprepningar om 50 mg/kg). Trots en tidigare visad möjlighet att påtagligt påverka den intraneuronala 5-HT omsätt-ningen i CNS med en TRP manipulation både i normalfallet och efter PCS, angav resultaten från detta delarbete att 5-HT frisättningen i hjärnbarken inte uppvisade någon skillnad mellan PCS och kontrolldjur avseende vare sig den akuta effekten efter laddningsdosen av TRP eller efter upprepad dosering. Detta fynd förvånar ytterligare eftersom vi också kunnat påvisa att TRP vid upprepad dosering tycks utöva olika kinetik mellan kontroller och PCS i CNS (delarbete II). I delarbete V mättes neuronalt frisatt 5-HT i hjärnan efter i.p. injektion av en koma-inducerande ammoniumacetat (NH4Ac) dos för att studera ett eventuellt samband mellan frisättningen av 5-HT och den därpå raskt försämrade symptombilden under ett reversibelt komatillstånd. NH4Ac-behandlingen av PCS råttorna visade sig ge en kortvarigt ökad 5-HT frisättning när dessa råttor föll i koma. Detta tolkade vi som att en ökad 5-HT frisättning möjligen kan ha en direkt betydelse för utvecklandet av akut leverkoma under vissa betingelser. Dessa resultat gav dock utom allt tvivel belägg för att en kraftig ammoniakstegring i hjärnan i sig, åtminstone vid kronisk PSE, kan ha en påtaglig 5-HT frisättande potential in vivo. Detta fenomen har tidigare antytts vara möjligt men enbart utifrån studier under in vitro betingelser med synaptosompreparationer. Koppling till faktiska symptom som ett komatillstånd är genom denna studie därför nyupptäckta. Trots att den basala neuronala frisättningen av 5-HT tycks vara oförändrad hos PCS råttor kvarstår möjligheten att frisättningsmönstret av 5-HT kan vara förändrad men att det inte har kunnat avslöjas med de metoder vi hittills använt oss av. I delarbete VI studerade vi därför kaliuminducerad 5-HT frisättning hos PCS råttor. Kaliumklorid (KCl) tillsatt till dialyslösningen gav ökningar av 5-HT frisättningen i hjärnan hos både PCS och sham-opererade kontrollråttor. Det mest intressanta fyndet i denna studie var dock att höjningen av 5-HT frisättningen efter KCl behandling var betydligt större hos PCS råttorna än hos de sham-opererade kontrollerna. Vi drog därför slutsatsen att en möjlighet föreligger att frisätta mer 5-HT i hjärnan vid experimentell LE även under andra betingel-ser än enbart under ammoniakbelastning. I delarbete VII utsatte vi PCS och sham-råttor lokalt via dialysproben för två selektiva 5-HT frisättande substanser, p-kloramfetamin (pCA) and d-fenfluramin (dFEN), och vi mätte halterna av bl.a. 5-HT i dialysatet därefter. Både pCA och dFEN är potenta, relativt selektiva, men principiellt olika 5-HT frisättande substanser. I tidigare studier har pCA visat sig frisätta både s.k. vesikulärt upplagrat 5-HT och icke-vesikulärt 5-HT befintligt i nervcellens cytosol. Frisättningsmekanismen hos dFEN har visat sig vara starkt koncentrationsberoende, och vid den koncentration som användes i denna studie tros dFEN endast frisätta 5-HT som lagrats i vesiklar i nervändar. Liksom i fallet med KCl behandling (delarbete VI) resulterade pCA perfusion i att mer 5-HT frisattes hos PCS råttorna än hos kontrollerna. Vid behandling med dFEN å andra sidan kunde ingen skillnad noteras mellan PCS och kontrollråttor i storleken på mängden av det frisatta 5-HT i hjärnbarken. Detta har vi preliminärt tolkat som att mängden omedelbart frisättningsbart 5-HT i nervcellen (d.v.s. vesikulärt lagrat) är lika stor hos PCS och kontrollråttor men att hos PCS råttorna finns det betydligt mer 5-HT i cytosolen vilket eventuellt kan mobiliseras för frisättning i vissa situationer. I det sista delarbetet avsåg vi främst att bl.a. undersöka farmakodynamiska men även vissa farmkokinetiska egenskaper hos den selektiva serotoninåterupptagshämmaren (eng. ”SSRI”) citalopram vid experimentell LE. SSRI preparaten är idag de mest förskrivna antidepressiva läke-medlen och används även till patienter med leverdysfunktion och därmed även latent PSE (som inte sällan lider av depressions- eller andra psykiatriska symptom), trots att detaljerna kring SSRI-preparatens påverkan (farmakodynamik) och omsättning på/i kroppen (farmakokinetik) är långt ifrån klarlagd för t.ex. patienter med leverinsufficiens och/eller PSE. Resultat från detta kliniskt inriktade djurexperimentella delarbete visade på skillnader både i de farmkokinetiska såsom de farmakodynamiska effekterna för citalopram hos PCS råttor vid jämförelse med normala kontroll-djur. Vi föreslår därför att ett strikt kontrollerat och mycket välmotiverat användande av dessa potenta centralnervösa läkemedel sker tills egenskaperna hos sådana preparat vid behandling av patienter med bl.a. funktionssvikt i levern är bättre utredda. Vi föreslår dessutom att den aktuella avhandlingen har visat på en möjlig djurexperimentell modell att använda för att bl.a. öka säker-heten kring användandet av nyare neuropsykofarmaka till t.ex. patientgrupper med leversjukdom.