Alternative NAD(P)H dehydrogenases in plant mitochondria - localisation, catalytic functions and physiological roles

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Alla flercelliga organismer är uppbyggda av celler. Cellen omges av ett plasmamembran, som innesluter cellens vätska (cytosol) i vilken finns små organeller. Varje organell har sin uppgift i cellen, som t.ex. kärnan innehåller genetiskt material (DNA) och mitokondrier producerar energi i form av ATP. Många uppbyggnadsprocesser som sker i celler t.ex. proteinsyntes kräver ATP som energikälla. Energin kommer ursprungligen från olika källor t.ex. socker eller fett, innan den kan omvandlas till ATP. Växter är speciella i med att de har två olika organeller som kan producera ATP. När det är soligt tar växter upp solenergi och omvandlar den till ATP i kloroplaster. Detta ATP används sedan av växten för att producera socker och stärkelse. Under natten bryter växterna ner en del av socker och stärkelse till pyruvat och malat som tas upp av mitokondrier för att producera ATP. På senare tid har man upptäckt att mitokondrier är aktiva även i solljus genom s.k. fotorespiration. Fotorespirationen behövs för att kloroplasterna skall kunna fungera. Mitokondrier omges av två membran. Yttermembranet är genomsläppligt för mindre molekyler, medan det inre membranet är ogenomsläppligt förutom för ämnen som har specifika transportörer i membranet. Detta innebär att utrymmet mellan membranen har liknande sammansättning av mindre molekyler som cytosolen, medan utrymmet (matrix) omgivet av innermembranet har egen miljö. I mitokondriens innermembran finns s.k. elektrontransportkedja (ETC), som tar upp elektroner från molekylerna NADH och FADH2 och transporterar dem via olika proteiner i ETC till syre som tar upp elektronerna och protoner och bildar vatten. Samtidigt som elektronerna överförs i kedjan transporteras protoner ut i utrymmet mellan membranerna. Eftersom protonerna inte kan ta sig tillbaka till matrix ansamlas de och bildar s.k. protongradient. Denna utnyttjas av ett protein som bildar ATP, samtidigt som proteinet transporterar protonerna tillbaka till matrix. I växtmitokondrier finns det specifika proteiner i ETC som inte transporterar protoner d.v.s. de bidrar ej till uppbyggandet av protongradienten och därmed ATP produktionen. Dessa extra "energislösande" enzymerna gör att energiproduktionen blir mindre effektiv. Det finns fem "energislösande" enzymer, alternativt oxidas och fyra s.k. alternativa dehydrogenaser – två interna, som sitter vända mot matrix: en för NADH och en för NADPH, samt två externa, som är vända mot utrymmet mellan membranerna: en för NADH och en för NADPH. Aktiviteten på de externa dehydrogenaserna kan bestämmas i isolerade mitokondrier genom att tillsätta NADH eller NADPH och mäta syreförbrukningen. Då kan aktiviteten bestämmas specifikt för antingen ena eller andra enzymet. Däremot är det inte lika lätt att bestämma aktiviteten för de interna dehydrogenaserna, eftersom varken NADH eller NADPH kan transporteras genom innermembranet. För att kunna mäta aktiviteten på dessa enzymer brukar man använda metoder som tar sönder innermembranet. Då kan man mäta aktiviteten på interna dehydrogenaserna, eftersom de förstörda membranen brukar bilda vesiklar med interna enzymer på utsidan. Vi har undersökt en annan metod där ett antibiotikum, alamethicin, används. När alamethicin tillsätts till isolerade mitokondrier bildar den kanaler i det inre membranet som gör att NADH och NADPH kan komma in i matrix. Med alamethicin uppmätte vi snabbare syreförbrukningshastigheter för interna NADH enzymer, än då vesiklar användes. Detta innebär att alamethicin är en bra metod för att bestämma aktiviteten på interna enzymer och kommer att utgöra viktig teknik för karakterisering av aktiviteter för interna NADH dehydrogenaser. Arabidopsis (backtrav) är en liten växt, vars arvsmassa är känt. Vi har därför undersökt hur många olika gener (DNA bitar) det finns, som kodar för alternativa dehydrogenaserna. Vi fann 7 gener, vilket motsvarar 7 olika proteiner. Dessa visade sig tillhöra 3 olika genfamiljer, nämligen nda, ndb och ndc. Släktskapen baseras på likheten i aminosyrasekvensen (byggstenarna i proteiner). Proteinerna uppdelas på 2 stycken NDA proteiner, 4 NDB proteiner och 1 NDC protein (Artikel II). Representanter från varje familj undersöktes för lokalisering och alla visade sig vara mitokondriella proteiner (Artikel II). NDA och NDC är förmodligen interna alternativa dehydrogenaser, medan NDB är externa alternativa dehydrogenaser (Artikel II, III). Alla gener i organismer regleras d.v.s. proteiner som kodas av sina respektive gener bildas inte hela tiden eller i alla organ. Man kan bestämma vilka gener som är aktiva genom att undersöka mängden av mRNA tillhörande generna. Stora mängder av RNA betyder att genen är aktiv och förmodligen finns det kodade proteinet i cellen. I artikel II visade vi att nda1 genen regleras av ljus, eftersom när växterna utsattes för kontinuerligt mörkret (4 dagar), kunde mängden mRNA från nda1 genen inte detekteras. Man har tidigare sett att det finns flera mitokondriella enzymer som regleras av ljus. Dessa enzymer är involverade i fotorespirationen och det är möjligt att även NDA1 proteinet är involverat i fotorespirationen. I artikel III karakteriserar vi genprodukten för ndb1 genen från potatis. Vi satte in potatis genen i tobak för att kunna se vilket protein ndb1 genen kodar för. I de tobaksväxterna där mRNA och protein nivåer av NDB1 ökade detekterade vi hög aktivitet av extern NADPH. I andra växter kunde varken mRNA eller proteinet detekteras och där var extern NADPH aktivitet väldigt låg. Därför kunde vi fastställa att NDB1 proteinet är en extern dehydrogenas som använder NADPH. Vi har inte kunnat fastställa proteinets funktion, men vi har sett att proteinet kan vara involverat i ökning av mängden alternativa energislösande enzymerna. Emellertid är det oklart på vilket sätt NDB1 gör det. Många viktiga experiment återstår att göras för att kunna förklara vilken funktion de energislösande enzymerna har i växter.