Sensitivity and selectivity studies in capillary electrophoresis

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Vad arbetar en analytisk kemist med? Exempel på kemiska analyser är att en idrottsman ska dopingtestas eller att eventuella föroreningar i vattnet från en bäck ska bestämmas. Den analytiska kemistens problemställning är vanligtvis att identifiera (kvalitativ analys) och mäta upp (kvantitativ analys) innehållet i ett prov. Ofta är de intressanta ämneshalterna mycket låga och förekommer i prover med många andra ämnen. Ibland kan dessutom provmängden vara synnerligen begränsad. Så är ofta fallet vid kriminalteknisk analys eller vid blodprovsanalys från spädbarn. Den analytiska kemisten är alltså i stort behov av känsliga och effektiva analysmetoder. Nål i höstack Problematiken är att bland kanske hundratals olika ämnen hitta och mäta just det man är intresserad av. Analysmetoden måste alltså vara selektiv, dvs ha en förmåga att skilja ett mycket stort antal olika ämnen åt. Koncentrationen av substansen som ska bestämmas mäts av en sensor eller detektor som känner av provet. Det kan exempelvis vara den UV-absorberande förmågan hos provet som mäts eller dess förmåga att leda ström. Om inte detektorn är tillräckligt selektiv kan den ge samma utslag för många olika substanser och hur ska man då veta att utslaget kommer från den substans man är intresserad av? Lösningen kan vara att sensorn endast nås av en substans i taget vilket innebär att ämnena i provet först måste separeras från varandra. Ny separationsmetod Genom att utnyttja små skillnader i ämnenas egenskaper kan de separeras. Egenskaper som ofta utnyttjas är storlek, laddning, kokpunkt, löslighet, samt vattenskyende eller vattenälskande förmåga. En ny separationsmetod där framför allt skillnader i laddning och storlek utnyttjas är kapillärelektrofores, som studerats i detta avhandlingsarbete. En liten provvolym trycks in i ena änden av en kapillär (ett smalt rör med samma innerdiameter som ett hårstrå). Kapillären är fylld med vätska. Över den 20-100 cm långa kapillären läggs en hög spänning (30 kV). De laddade provmolekylerna börjar då att vandra. Om betingelserna väljs rätt vandrar olika ämnen olika snabbt och kommer alltså fram till andra änden av kapillären vid olika tidpunkter. Där är detektorn placerad. OS för molekyler Separationen kan jämföras med ett sprinterlopp. Provmolekylerna eller löparna radas upp på startlinjen. De springer därefter den aktuella sträckan efter sin förmåga. Vid mållinjen är tidtagaren eller detektorn placerad. Kapillärelektrofores kan användas för att separera allt från små oorganiska joner till stora makromolekyler som proteiner och DNA. I den här avhandlingen har framför allt ämnen som används som läkemedel separerats. Det finns spegelbildsisomerer (som vänster och höger hand) av många ämnen. Då dessa används som läkemedel finns det alltså två olika molekyler av den aktiva substansen. Dessa spegelbildsisomerer kan ha helt olika verkan i kroppen eftersom de fungerar olika tillsamman med andra spegelbildsisomerer (höger hand passar bara i höger handske). Hinder på banan Om två ämnen har lika stor förmåga att ta sig fram (spegelbildsisomerer har samma storlek och laddning) gäller det för den analytiska kemisten att sätta ut hinder på banan eller förse en av de tävlande med fotboja så att tävlingen blir mer utslagsgivande. Det görs genom att till vätskan som kapillären fylls med, sätta olika ämnen som de intressanta provmolekylerna kan samverka med. I avhandlingen har spegelbildsisomerer separerats genom tillsats av sockerringar, cyklodextriner. Då spegelbildsisomererna binder till cyklodextrinmolekylen ändras deras förmåga att ta sig fram. Genom att de två spegelbildsisomererna binder olika hårt (tillbringar olika lång tid med) cyklodextrinmolekylen kan de separeras. Även ytaktiva ämnen som aggregerar till miceller har använts för att inverka på provmolekylernas vandringshastighet. På åskådarplats En ny detektor har använts för att studera händelseförloppet under separationen. En laserstråle belyser hela kapillären, från inlopp till utlopp. Om rätt våglängd används kan vissa provmolekyler inuti kapillären sända ut ljus (fluorescera) av en annan våglängd. Det utsända ljuset mäts med hjälp av en kamera. En bild tas av kapillären. Om flera bilder tas efter varandra erhålls en film. Upp till 200 bilder per sekund kan tas med den aktuella utrustningen vilket gör det möjligt att studera mycket snabba förlopp. I varje ögonblick mäts alltså flourescensen längs hela kapillären och inte bara vid mållinjen. Nu är det alltså möjligt att följa hela förloppet och precis som från åskådarplats följa löparna på banan. Separation av spegelbildsisomerer har visualiserats med hjälp av den nya detektorn. Med den avbildande detektorn minimeras den tid som måste avsättas för varje analys. Målet är ju nått så snart ämnena separerat vilket för gynnsamma analyser kan ske efter några få millimeter. Trängsel på startlinjen Då ämnena väl separerats gäller det att kunna detektera dem. För att mäta låga koncentrationer har olika sätt att anrika provet före separationen studerats. Teknikerna som använts har speciellt anpassats till de små provvolymer som används i kapillärelektrofores. Provvolymen som introduceras i kapillären är normalt några få tusendelar av en mm3. I kapillärens inlopp har ett material placerats som provmolekylerna binder till under vissa betingelser. Stora provvolymer (flera mm3) introduceras samtidigt som provmolekylerna fastnar. De kan sedan lossas för att separeras. Koncentreringsfaktorn var mellan 1000-10000 gånger med denna metod. En annan enkel och vanlig metod för koncentrering är att avdunsta lösningsmedlet. För att kunna hantera de små volymer det handlar om i kapillärelektrofores användes levitering. Provdroppen som tilläts avdunsta svävade i luften fångad i en stående ljudvåg. Provdroppen plockades efter ungefär 20 min upp med kapillären för analys. Koncentreringsfaktorn var här drygt 100 gånger.