Assessment of eosinophil degranulation in allergic diseases and experimental models

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Den eosinofila granulocyten är en typ av vit blodkropp som ingår i kroppens immunförsvar. Vid allergirelaterade sjukdomar ses en ökad mängd av eosinofiler i blodbanan samt lokalt i den allergiskt inflammerade vävnaden. I vävnaden släpper eosinofilerna ut sina granulaproteiner som har celldödande, immunförsvarsreglerande och tillväxtfrämjande egenskaper. Hos patienter med allergiska sjukdomar som t ex. astma, hösnuva och atopiskt eksem sker denna granulaproteinfrisättning, dvs degranulering, via två olika mekanismer. I det ena fallet sker en gradvis minskning av eosinofilens granulainnehåll där proteinerna transporteras via små vesikulära strukturer till cellmembranet och vidare ut från cellen s.k. piecemeal degranulation. I det andra fallet sker en dramatisk frisättning av eosinofilens totala innehåll på grund av bristningar i cellmembranet vilket leder till celldöd (cytolys). Eftersom eosinofilinvandring och degranulering är karakteristiskt för allergiska tillstånd kan förändringar i eosinofilens cellstruktur vara en biologisk markör för sjukdomsprocessen i den inflammerade vävnaden och användas för att utvärdera olika farmakologiska behandlingar. Med avseende på den upplösning och specificitet som behövs för att upptäcka strukturförändringar i eosinofilen krävs elektronmikroskopiska studier på cellorganellsnivå (s.k. ultrastrukturella studier). Trots att eosinofilens aktivering i olika biologiska system studerats intensivt är det få som har utfört ultrastrukturella studier. Därför finns ett stort behov att visa på och förklara uppkomsten och regleringen av eosinofildegranulering mer i detalj vid allergisk sjukdom, men också i de experimentella djur- och cellmodeller som används för att studera cellaktivering och den allergiska sjukdomsprocessen. Den första studien i denna avhandling karakteriserar och beskriver eosinofilernas degranuleringsgrad i de vanligaste djurmodellerna använda för forskning om astma och hösnuva. För närvarande används framför allt möss som efter upprepad exponering med allergen får en astmaliknande eosinofilrik inflammation. Trots att dessa allergiska möss har en ökad mängd eosinofiler i luftvägsslemhinnan har aktiveringsgraden av dessa eosinofiler inte studerats i detalj, kanske beroende på att degranulering tagits för givet. I studie I görs även en jämförelse mellan blodeosinofiler från mus och människa avseende förmågan att reagera på inflammatoriska stimuli. Studiens resultat visar att i motsats till sjukdomstillståndet hos människa så uppvisar inte mössen I de experimentella modellerna någon synbar eosinofildegranulering i sina luftvägsslemhinnor. Musens blodeosinofiler visar även en sämre förmåga att frisätta sina granula proteiner jämfört med människans eosinofiler. För att klargöra om de underliggande skillnaderna i eosinofilernas förmåga att degranulera in vivo och in vitro beror på skillnader mellan mus och människa eller på otillräcklig stimulering I de djurexperimentella modellerna behövs ytterliggare studier. Vår slutsats är att den hos dessa allergisk möss uppvisdade eosinofilrika inflammationen inte avspeglar den allergiska sjukdomen hos människa. Sålunda är det mycket svårt att genom studier med allergiska musmodeller dra några slutsatser om eosinofilernas roll och påverkan vid allergisk sjukdom i luftvägarns hos människa. För att undersöka eosinofilernas degranuleringsmekanismer studeras vanligen isolerade blodeosinofiler som efter stimularing in vitro frisätter granulaproteiner. I de flesta sådana studier kan man dock även se en svag frisättning av granula protein från celler som ej blivit stimulerade. Det är tänkbart att eosinofilerna under själva uppreningsprocessen från blodet kan stimuleras så att de börjar degranulera. I den andra delen av denna avhandling undersöks därför om det överhuvudtaget är lämpligt att använda isolerade eosinofiler för att studera övergången från en vilande till en degranulerande eosinofil. För att kunna bedöma om det skett en förändring av cellens struktur efter upprening från blodet krävs först en detaljerad beskrivning på hur ultrastrukturen hos eosinofilerna ser ut i sitt ursprungstillstånd, dvs i blodcirkulationen hos en frisk människa. För att studera eosinofilernas baslinjestruktur i blod togs därför en ny metod fram i syfte att stabilisera cellstrukturerna direkt efter provtagning (genom fixering med cellstabiliserande lösning). Eftersom antalet eosinofiler i blodet normalt är lågt, justerades även prepareringsprocessen så att eosinofilantalet i preparatet koncenrerades. Studiens resultat visar att traditionellt upprenade humana blodeosinofiler uppvisar kraftiga skador på granulastrukturerna med tydliga tecken på förlust av proteinnehåll. Vi fann att processen där de röda blodkropparna avlägsnas (lysering genom isotonisk ammoniumkloridbehandling eller hypotonisk vattenbehandling) orsakar denna skada. Vidare förvärrades denna skada vid fortsatt separeringsprocess. De synbara granulaförändringarna liknade de som karakteriserar en aktiv degranulering av vävnadseosinofiler vid allergisk sjukdom. Detta resultat uppmanar till försiktighet att dra några slutsatser om den tidiga regleringen av eosinofildegranulering från den stora mängd data som erhållits från tidigare studier, som utförts med redan degranulerade eosinofiler. För att erhålla eosinofiler med minimala granulaförändringar togs därför en alternativ reningsprocess fram där lyseringsmetoden för borrttagning av röda blodkroppar ersattes med en densitets- centrifugering. Med hjälp av denna metod är det nu möjligt att studera uppkomsten och den tidiga regleringen av eosinofilernas degranulering. Den tredje och sista studien i avhandlingen syftar till att studera om eosinofiler frisätter granulaproteiner redan i blodcirkulationen hos patienter med symptomatisk allergisk sjukdom. Om detta vore fallet skulle en bestämning av degranuleringsnivån kunna avspegla sjukdomsförloppet i vävnaden och vara en värdefull diagnostisk markör. Med hjälp av den framtagna metoden för direkt fixering av blod (studie II) kunde vi studera eventuella avvikelser i cellstruktur hos blodeosinofiler från patienter med olika allergiska sjukdomar av varierande svårighetsgrad. Vi fann dock att blodeosinofilerna vid dessa tillstånd, till skillnad från vävnadseosinofiler, saknar ultrastrukturella tecken på proteinfrisättning från sina granula. Denna skillnad i aktivering visar sålunda att eosinofiler på sin väg från benmärg, via blodcirkulationen, till den sjuka vävnaden befinner sig i olika aktiveringsstadier och därmed kan ha olika funktion samt även vara mer eller mindre mottagliga för farmakologisk behandling. Avsaknaden av eosinofil degranulering i blod trots svår allergisk sjukdom, innebär att man inte bör studera blodeosinofilerna för att dra några slutsatser om degranuleringen i den sjuka vävnaden. Inte heller kan blodeosinofilernas ultrastruktur fungera som markör för den allergiska sjukdomsprocessen. Sammantaget understyker resultatet av studierna i denna avhandling vikten av att kontrollera och säkerställa degranuleringsnivån av eosinofiler vid olika typer av provtagning och efter olika behandlingar, metodologiska såväl som farmakologiska, för att kunna bestämma eosinofilernas effekter och sålunda roll vid allergisk sjukdom.