Gene Expression Studies of Hematologic Malignacies

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Varje år insjuknar ca 460 personer i akut leukemi (blodcancer) i Sverige. Leukemi är en sjukdom som drabbar celler med viktiga funktioner i vårt immunförsvar och kännetecknas av att omogna celler ansamlas i framförallt benmärg och blod. Bristen på mogna och fungerande vita blodceller i benmärgen leder till en ökad infektionsbenägenhet, ökad risk för blödningar och blodbrist. Frekvensen av leukemi hos vuxna ökar med åldern och den vanligaste typen av leukemi hos äldre är akut myeloisk leukemi (AML). Hos barn ser mönstret annorlunda ut, med högst förekomst i 3-5 års ålder och barn drabbas framförallt av akut lymfatisk leukemi (ALL). Vår arvsmassa (generna) finns lagrad som DNA i kromosomerna vilka finns i cellkärnan i varje cell i vår kropp. Cancer är en sjukdom som kännetecknas av förvärvade genetiska förändringar (mutationer) i DNA och där en ansamling av dessa vanligtvis sker vid cancerutveckling. Leukemier kännetecknas av specifika kromosomförändringar och sedan den första genetiska avvikelsen beskrevs 1960 av Nowell och Hungerford har nu fler än 350 återkommande genetiska förändringar identifierats vid leukemi. En vanlig genetisk avvikelse utgörs av så kallade translokationer, vilka innebär att genetiskt material från två olika kromosomer sätts samman och därigenom ger upphov till en ny sammanslagen gen, en sk fusionsgen. Fusionsgenen i sin tur bildar ett förändrat protein med canceromvandlande egenskaper. Eftersom fusionsgener många gånger består av sk transkriptionsfaktorer, det vill säga gener som styr andra geners uttryck, leder uttrycket av fusionsgenen till förändring i regulatoriska nätverk som styr viktiga funktioner för cellens tillväxt, utmognad och överlevnad. Förekomsten av en fusionsgen ger information om vilken typ av leukemi det rör sig om och många gånger erhålls viktig prognostisk information. Ibland kan den specifika fusionsgenen dessutom ha betydelse för vilken typ av behandling som den enskilda patienten får. Trots att leukemier har studerats under lång tid är kunskapen om hur uttrycket av en fusionsgen ger upphov till leukemi relativt begränsad. I mitten på 1990-talet introducerades microarray-teknologin (på svenska ?mikromatris?), vilken har kommit att revolutionera vår möjlighet att studera hur cancer förändrar cellernas genetiska program. Microarraytekniken gör det möjligt att i ett enda försök studera uttrycket av tusentals gener och ger således ett molekylärt avtryck av de gener som är uttryckta i en vävnad vid ett visst tillfälle. Cancer är en sjukdom som kännetecknas av att genetiska program som styr cellens utmognad, delning och död är störda. I leukemier är det ofta gener som kodar för konserverade transkriptionsfaktorer med viktiga funktioner i cellernas utmognad som är förändrade, vilket karakteristiskt kan ses som en blockering vid ett visst mognadsstadium. Genuttrycksmönstret i leukemicellerna kommer därför att reflekteras av vilka gener som är förändrade och vid vilken mognad cellerna blockerats. Eftersom arrayteknologin är så kraftfull finns det hopp om att den ska kunna användas diagnostiskt för att klassificera leukemier till kända grupper och för att identifiera undergrupper med bättre eller sämre prognos. Vidare ger den viktig information om de genetiska program som är förändrade till följd av leukemiuppkomsten. Den övergripande målsättningen i denna avhandling har varit att använda microarrayteknologin för att utveckla diagnostiska klassningsverktyg samt studera de gener som förändrats vid leukemi. Vidare var målsättningen att finna nya undergrupper av leukemier med en bättre eller sämre prognos. Fyra delarbeten ingår i avhandlingen; i det första studerades genuttrycksprofilerna hos ett stort antal leukemicellinjer (Artikel 1). Cellinjer är viktiga modellsystem för att studera hur leukemier uppkommer och för att undersöka vilka genetiska program eller signalvägar som är störda vid leukemi. Det är känt att genetiska förändringar ansamlas när cellinjerna odlas i laboratoriet, men det har varit okänt huruvida de bibehåller det ursprungliga genuttrycksmönstret som kännetecknar den primära genetiska avvikelsen i leukemicellerna. Ett stort antal cellinjer och patienter med specifika genetiska förändringar undersöktes och visade att leukemicellinjer bibehåller ett genuttrycksmönster som speglar den primära genetiska förändringen trots att de har olika ursprung och har odlats under lång tid i skilda laboratorier. Denna kunskap är viktig eftersom leukemicellinjer är några av våra främsta verktyg för att studera de genetiska nätverk som förändrats vid leukemi. I ett andra arbete studerades 121 barnleukemier och ett stort antal normala blodceller av olika typer och mognadsstadium (Artikel II). Denna undersökning visade att barnleukemier med karakteristiska genetiska avvikelser hade unika genuttrycksmönster. Vidare studerades uttrycksmönstret av gener som var associerade med primära genetiska förändringar i normala hematopoietiska celler av olika typer och mognadsgrad, vilket visade att flertalet gener var selektivt högt uttryckta i leukemicellerna. Detta kan tyda på att leukemierna aktiverar gener som inte är uttryckta under normal utmognad. Det är troligt att dessa gener är viktiga för leukemiuppkomsten och att de därmed också eventuellt kan fungera som mål för utveckling av framtida terapier. I delarbete tre var syftet att använda matematiska/statistiska metoder för att undersöka om genuttrycksmönstret i leukemicellerna kunde användas för att förutsäga vilken typ av leukemi ett prov tillhörde samt om viktiga kliniska parametrar kunde förutspås redan vid diagnostillfället (Artikel III). Leukemierna kunde klassificeras med hög precision avseende vilken typ av leukemi och genetisk avvikelse det rörde sig om, något som visar att genuttrycksanalyser kan utgöra ett viktigt instrument för klinisk diagnostik av leukemier. Man vet idag att kvarvarande leukemiceller dag 29 efter inledande behandling ökar risken för återfall och av den anledningen undersökte vi det om dessa patienter gick att identifiera redan vid diagnostillfället. På basis av genuttrycksmönstret vid diagnos var det möjligt att klassificera T-cellsleukemier beroende på om de skulle ha kvarvarande leukemiceller dag 29. En sådan prediktor kan i framtiden vara ett betydelsefullt kliniskt verktyg för att förbättra riskgrupperingen för denna leukemiform. I det fjärde arbetet undersöktes brottspunkterna i en karakteristisk translokation ? t(12;14)(p13:q11) ? i två fall av T-cellsleukemi hos barn (Artikel IV). Fluorescent in situ hybridisering visade att brottspunkten i kromosom 14 låg i T-cellsreceptor alpha/delta lokus och i närheten av genen CCND2 på kromosom 12. Microarray analys användes därefter för att undersöka uttrycket av 8 gener runt brottspunkten på kromosom 12. Denna analys visade att CCND2, en gen som är viktig för celltillväxt, var högt uttryckt i jämförelse med andra T-cellsleukemier, medan de andra generna uppvisade ett likartat uttryck i alla leukemierna. Detta fynd, som kunde bekräftas med sk realtids-PCR, är det första exemplet på dereglering av en cyclinrelaterad gen i T-cellsleukemi. Sammanfattningsvis har studierna i denna avhandling bidragit till en ökad kunskap om de genuttrycksmönster och regulatoriska nätverk som förändras vid leukemi. Ett stort antal gener med ett selektivt högt uttryck i leukemiceller kunde identifieras, vilka ger viktig information om vilka genetiska program som är störda vid leukemi. Förhoppningsvis kan dessa gener i framtiden utgöra attraktiva mål för utveckling av nya behandlingsformer.