Structure and expression of the TP and EP1 prostanoid receptor genes

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Prostanoider, en samlingsbeteckning för prostaglandiner och tromboxaner, tillverkas av de flesta av kroppens olika celltyper och fungerar som en slags hormoner i många olika organsystem i människor och djur. Prostanoiderna bildas alla från prostaglandin H2 som i sin tur tillverkas av enzymet cyklooxygenas (COX) från fettsyran arachidonsyra. Prostanoiderna är alltså fettämnen som fungerar som signalbärare i kommunikationen mellan olika celler i kroppen. Att cellerna kommunicerar med varandra är utmärkande och mycket viktigt i alla flercelliga organismer, som t.ex. oss människor. Det kan nämnas att det stora flertalet av de läkemedel som används inom sjukvården, verkar genom att påverka olika signalsystem. Detta kan t.ex. ske genom att läkemedlet ökar tillverkningen av ett signalämne eller genom att det blockerar receptorn, mottagaren, för ett visst ämne. I denna avhandling har jag framför allt studerat receptorerna för två prostanoider, nämligen receptorerna för prostaglandin E2 och tromboxan A2. De båda receptorerna betecknas EP1 respektive TP. Prostanoid-receptorer är proteiner som sitter i cellmembranet på vissa celler. Den del av receptorn som vetter utåt fångar upp och binder prostanoider medan den del som är vänd mot cellens insida är kopplad till andra signalerings-proteiner inuti cellen. Prostanoid-receptorerna är alltså proteiner, vilket innebär att de består av en lång kedja (sekvens) av aminosyror. Denna sekvens av aminosyror är unik för varje typ av receptor och bestäms av receptorns gen och den DNA-sekvens som genen utgörs av. Genom att isolera (klona) prostanoid-receptorernas gener och läsa genernas DNA-sekvens, kan man räknas ut receptorernas aminosyra-sekvens och därmed lära sig mycket om receptorernas struktur och funktion. Just detta har varit huvudsyftet med den föreliggande avhandlingen. I delarbete I beskriver jag hur vi klonat ett stycke mus-DNA som innehåller genen för TP-receptorn (tromboxan A2-receptorn) och visar genens DNA-sekvens samt att genen är uppdelad i tre avsnitt (exoner). I detta delarbete konstaterar jag vidare att TP-receptorn uttrycks (bildas) bl.a. i mjälten och brässen (thymus). Dessa båda organ innehåller mycket lymfocyter, en slags vita blodkroppar, varför vi drar slutsatsen att det är just lymfocyterna som bildar TP-receptorn. Dessa resultat antyder att TP-receptorn har en viktig funktion inom immunförsvaret. I det andra delarbetet visar jag på motsvarande sätt hur vi klonat mus-genen för EP1-receptorn, bestämt dess DNA-sekvens, dess struktur och i vilka vävnader som EP1 receptorn uttrycks. EP1-genen är organiserad på ett sätt som liknar TP-genen i det att också den är uppdelad i tre avsnitt/exoner. Vi undersöker också var i musens njure och hjärna som receptorn finns och finner att EP1 finns i celler i njurens samlingsrör samt i två distinkta delar (kärnor) av hypotalamus – i hjärnan – som kallas Nucleus paraventricularis (PVN) och Nucelus supraopticus (SON). Det är känt sedan tidigare att dessa båda kärnor är inblandade i hjärn-funktioner som har med reglering av kroppstemperturen att göra. Det är också känt att prostaglandin E2 deltar i den process som leder fram till feber i samband med t.ex. en infektion i kroppen. Utifrån denna kunskap framkastar vi hypotesen att EP1-receptorn är delaktig i tillkomsten av feber. I samband med att vi undersöker genen för EP1-receptorn upptäcker vi att det finns en främmande gen på EP1-genens ”baksida”. DNA-strängarnas nukleotidsekvens kan läsas från två håll, ungefär som vanlig text kan läsas antingen från höger eller vänster. Om man läser sekvensen för en viss gen baklänges, erhåller man i normalfallet bara nonsens-information – sekvens-information som inte läses av (transkriberas) och inte blir mRNA. Men när vi tar DNA-sekvensen för EP1-genen och vänder den baklänges, ser vi att denna sekvens är identisk med en gen-sekvens som finns i DNA-databasen, nämligen sekvensen för PKN-genen. PKN är ett nyupptäckt s.k. proteinkinas. Efter närmare undersökningar konstaterar vi att PKN-genen helt överlappar EP1-genen på ett sådant vis att hela EP1-genen ligger inom PKN-genens avslutande parti, fast baklänges. Detta fynd avrapporterar jag i delarbete III. I det fjärde delarbetet gör vi en första ansats att undersöka prostanoid-receptorernas funktioner i hjärnan genom att bestämma var i råttans hjärna receptorerna för prostaglandin E2 finns. Det har länge varit känt att prostaglandin E2 har flera funktioner i hjärnan av vilka den feber-alstrande förmågan är den mest kända. Prostaglandin E2 fungerar sannolikt inte som en klassisk transmittorsubstans i hjärnan utan anses snarare fungera som en modulator av andra signalämnen. Kunskap om vilka receptorer som prostaglandinet verkar genom är viktig för skapandet av en bild av vilken betydelse och vilka funktioner prostaglandin E2 har i hjärnan. Studien är utförd i samarbete med två experter på nero-immunologi på Karolinska Institutet i Stockholm. Den metod vi använt kallas in situ-hybridisering och visar var i vävnaden – hjärnan i detta fall – som den studerade genen är aktiv. Det mest oväntade resultatet av undersökningen är att EP1-receptorn inte alls finns i råttans hjärna (jämför resultaten från mus-hjärna i delarbete II). Vidare visar vi att en receptor med beteckningen EP4 – som också är en receptor för prostaglandin E2 – finns i ett antal distinkta områden i hjärnan, bl.a. i hypotalamus och i hjärnstammen. Vi visar också att EP4-receptorn uttrycks i perifera nervknutor som tillhör vagus-nerven. Dessa resultat ger ledtrådar till vilka kända prostaglandin-effekter som kanaliseras genom EP4-receptorn och vilka andra fysiologiska processer som EP4-receptorn kan vara inblandad i. Uppsättningen prostanoider och prostanoidreceptorer är mycket snarlik, nästan identisk, mellan olika däggdjursarter. Detta innebär att kunskap om stuktur och funktion för prostanoiderna och deras receptorer i mus och råtta, även äger stor giltighet för människa. De aktuella undersökningarna visar dock att det även kan föreligga påtagliga skillnader mellan närbesläktade arter. I musens hjärna finner vi EP1 receptorn i PVN- och SON-kärnorna (delarbete II) medan denna receptor inte alls finns i råttans hjärna (delarbete IV). Däremot finns en annan prostanoid-receptor – EP4 – i just PVN- och SON-kärnorna i råtta. Denna skillnad mellan mus och råtta ska ses mot bakgrund av det faktum att aminosyra-sekvenserna för musens och råttans respektive prostanoid-receptorer är nästan identiska. En tänkbar förklaring till fenomenet är att EP4-receptorn i råttans PVN- och SON-kärnor upprätthåller samma funktioner som EP1-receptorn gör i musens.