Expression and Function of Human and Plant Aquaporins

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish En cell är den minsta beståndsdelen av det som vi definierar som liv. Cellen avgränsas av ett cellmembran som gör att rätt miljö, dvs rätt koncentration av alla nödvändiga molekyler, upprätthålls inuti cellen. Cellmembranet består bl a av olika slags fett, sk lipider. Många små molekyler kan fritt passera igenom membranet medan andra kräver specifika transportkanaler i membranet och dessa kanaler utgörs av proteiner. Dessa membranproteiner fungerar som grindvakter för cellen. Inuti cellen finns flera membranomslutna strukturer och på grund av sitt membran kan dessa ha olika interna miljöer vilket behövs för de olika reaktionerna i cellen. Vatten är en livsviktig molekyl för alla levande organismer och behövs i många fysiologiska funktioner. Celler omges av vatten men i kroppen utgörs den största mängden vatten av det som finns inuti cellen. Länge trodde man att vatten passerar över membranet enbart via diffusion. I slutet av 1980-talet upptäcktes ett protein av en slump i röda blodkroppar, ett protein som sitter i cellmembranet och bildar en kanal. Senare fann man att detta protein är selektivt permeabelt för vatten och gavs namnet aquaporin 1 (AQP1). Numera vet man att aquaporiner finns i alla levande organismer, från människa till bakterie. År 2003 delades Nobelpriset i kemi ut till Peter Agre för upptäckten av AQP1 och efter detta har intresset ökat för forskningen kring aquaporinerna och hur de fungerar, både inom grundforskningen och inom tillämpad forskning. AQP1 identifierades som en enbart vattentransporterande kanal. Nu vet man att flera medlemmar i aquaporinfamiljen även kan transportera andra molekyler. Trots att vatten kan diffundera över cellmembranet så gör aquaporinerna att vatten på ett mer effektivt sätt kan transporteras in och ut ur celler i de vävnader som kräver en snabb vattentransport. Människan har 13 varianter av aquaporiner (AQP0-12) och dessa finns i alla typer av vävnader i kroppen. Flera aquaporiner har sin specifika vävnadslokalisering, t ex i ögonen, njurarna, mag- tarmkanalen och huden. Om man har en förändring, en mutation, i den genen eller helt saknar den genen som kodar för en specifik aquaporin kan vissa sjukdomar uppstå. Målet med denna avhandling var att öka förståelsen för aquaporinernas funktion genom att studera dem i jästceller, Pichia pastoris, och i ägg från grodan Xenopus laevis, samt deras vävnadslokalisering i växtcellens kloroplast. Genom att genmodifiera Pichia pastoris så att den producerar den specifika aquaporinen vi vill studera, kan proteinet renas fram och sedan kristalliseras för att dess struktur på atomnivå ska kunna studeras (Paper I och II). För att kunna kristallisera ett specifikt protein behövs stora mängder av enbart detta protein. I Paper III utarbetade vi en metod för hur vi kan selektera dessa modifierade jästceller som bär på flera kopior av den gen som kodar för den specifika aquaporinen. En jästcell med flera kopior av den specifika aquaporin-genen kan potentiellt producera vår aquaporin med ett högre utbyte per jästcell. Tidigare har man lyckats få fram atomstrukturen på en spenataquaporin, SoPIP2;1. Det arbetet ledde fram till att man upptäckte en mekanism för hur aquaporinen kan regleras genom att öppnas och stängas när det utsätts för olika miljöer, såsom torka eller översvämning. Med denna kunskap som bakgrund var målet med Paper IV att mutera, dvs byta ut vissa av proteinets byggstenar de sk aminosyrorna, så att SoPIP2;1 låses i ett konstant öppet respektive stängt läge. För att kunna se om vattentransporten ökar eller minskar i dessa muterade aquaporiner, jämfört med den icke-muterade, så injicerar man den gen som kodar för dessa spenataquaporiner i grodägg från Xenopus laevis. Dessa grodägg har naturligt väldigt låg permeabilitet för vatten. Genom att grodägget får producera aquaporinen och att det lokaliserar till dess cellmembran förändras vattenpermeabiliteten och blir mätbar när man placerar grodäggen i en lösning som är mer utspädd än vad lösningen på insidan av grodägget har. För att utjämna koncentrationsskillnaden mellan in- och utsida passerar vatten in i grodägget via aquaporinen och till slut spricker ägget. Händelseförloppet filmas och hastigheten av vattentransporten jämförs mellan de grodägg som har producerat den muterade respektive icke-muterade aquaporinen. På så vis kan vi få reda på om mutationen bidrog till en ökad eller minskad vattentransport genom att aquaporinen låses i ett öppet respektive stängt läge. I Paper V ville vi undersöka om vi kunde hitta aquaporiner i växtens kloroplast. En kloroplast är en membranomsluten struktur inuti växtcellen som omvandlar vatten och koldioxid till socker och syrgas genom ljusenergi från solen, den sk fotosyntesen. Eftersom vatten behöver transporteras in i kloroplasten för att fotosyntesen ska fungera, ville vi undersöka om aquaporiner finns i kloroplaster och studera vilka varianter av aquaporiner som finns i de olika delarna av kloroplastens membran.