Biomarker Discovery in Cancer using Affinity Proteomics - Studies of B-cell lymphomas and Breast Cancer

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Antalet människor som insjuknar i cancer (cancerincidensen) runtom i världen ökar, exempelvis i Sverige har antalet diagnosticerade tumörer ökat med i snitt 2.1% per år de senaste 20 åren. Denna ökning förklaras bland annat av vår ökade livslängd och vårt val av livsstil. Trots detta har antalet människor som dör i cancer minskat de senaste 20 åren. Dessa motsägelsefulla fakta kan förklaras av framgångar inom cancerforskning, där nya och bättre metoder för diagnostik, prognostik och behandling av cancer har utvecklats. Statistiska prognoser visar dock att incidensen av cancer kommer att fortsätta öka. Man räknar idag med att var tredje person i Sverige kommer få en cancerdiagnos i sitt liv, och den siffran förväntas öka till varannan person inom den närmsta framtiden. Fortsatt utveckling av metoder för diagnostik, prognostik och behandling är därmed av yttersta vikt för att lyckas i kampen mot cancern. Sökandet efter biomarkörer, som denna avhandling handlar om, är ett exempel på sådan utveckling. Biomarkörer kan vara vad som helst som går att mäta och ger information om en patients sjukdomstillstånd. Oftast är det en gen eller ett protein, som är förändrat hos en patient som är sjuk i jämförelse med en som är frisk. Traditionellt sett har man letat efter enskilda biomarkörer för varje sjukdomstillstånd, men det har på senare år visat sig att det kan vara en fördel att istället leta efter flera proteiner eller gener som tillsammans kan ge information om patientens sjukdomstillstånd. I denna avhandling har just detta gjorts, vi har försökt hitta kombinationer av proteiner, eller proteinmönster, som kan identifiera olika cancertyper på ett specifikt sätt, på liknande sätt som ett fingeravtryck identifierar en viss individ och ingen annan. För att uppnå detta har vi använt oss av affinitetsproteomik. Proteomik innebär sökandet efter många olika proteiner på en och samma gång, och affinitetsproteomik innebär att man använder sig av exempelvis antikroppar i sökandet. Antikroppar är protein som tillverkas i våra kroppar som en del av vårt immunförsvar. När ett främmande ämne, t.ex. en bakterie, tar sig in i kroppen, lanseras ett enormt försvar med många olika beståndsdelar. En av dessa är antikroppar, vars uppgift är att binda fast till proteiner från bakterien, och därmed flagga för de andra beståndsdelarna av immunförsvaret att bakterien är farlig och måste förstöras. För att klara av det jobbet måste antikropparna ha två egenskaper. De måste ha hög affinitet, alltså binda starkt till det främmande ämnet, och de måste binda specifikt, alltså bara binda till det främmande ämnet och inte andra, exempelvis kroppsegna ämnen. Utöver detta måste det finnas en antikropp för varje tänkbart främmande ämne som kan komma in i vår kropp. Resultatet av detta är att kroppens celler kan tillverka antikroppar med 1011, alltså hundra miljarder, olika specificiteter. För att söka efter många olika proteiner på samma gång i ett och samma prov, har man härmat kroppens förmåga att skapa olika antikroppar på syntetisk väg. På så vis har många olika antikroppar, med hög affinitet men olika specificitet och därmed förmågan att binda olika proteiner, producerats på labbänken. Dessa syntetiska antikroppar kan användas för att fånga upp proteiner, potentiella biomarkörer, i det prov som analyseras. I vår teknik, antikroppschip, placeras dessa syntetiska antikroppar på en plastyta (chip) med hjälp av en robot. Roboten placerar en mycket liten droppe, 30 miljarddels liter, av varje antikropp med hög precision, så att dropparna bildar ett ordnat mönster på ytan, en array. Ett patientprov, t.ex. blod, urin eller vävnadsprov kan sedan tillsättas till arrayen, och de proteiner som finns i provet kan fångas upp av antikropparna. Varje array kan innehålla hundratals olika antikroppar, och på så vis kan hundratals olika proteiner analyseras på samma gång i ett prov. Sedan jämför vi alla proverna, och för att se om vi kan upptäcka skillnader i bindningsmönster mellan exempelvis prover från sjuka och friska patienter. Hittar vi sådana skillnader i bindningsmönster, har vi hittat potentiella biomarkörer! Min avhandling är baserad på fyra artiklar. I en av artiklarna utvecklade jag tekniken för att kunna analysera ett nytt provformat på våra antikroppschip. I de resterande tre artiklarna använde jag antikroppschipen för att leta biomarkörer för olika cancertyper. I den första artikeln, artikel I, designade jag ett protokoll som möjliggjorde analys av formalin-fixerad paraffin-inbäddad (FFPE) vävnad. FFPE är ett sätt att förvara vävnadsprover från tumörbiopsier i rumstemperatur och under lång tid. Provformatet används kliniskt i mycket stor utsträckning för diagnos av olika cancertyper, och har varit en gyllene standard i årtionden. Därför finns det stora arkiv av FFPE vävnad på sjukhus runtom i världen, vilka nu kan användas för biomarkörstudier på våra antikroppschip. I artikel II användes antikroppschipen för att hitta biomarkörer i olika typer av B-cells lymfom (BCL). Lymfom, en typ av cancer som drabbar ca 2000 svenskar årligen, utgår från de celler som utgör lymfan. Vid BCL sitter cancern i B-cellerna, en viktig celltyp i kroppens immunförsvar. Prognosen för BCL är väldigt olika beroende på typ, där vissa är aggressiva och andra indolenta (långsamt växande). Även inom de olika typerna är det svårt att fastställa rätt diagnos och prognos, eftersom de är mycket heterogena (olikartade), vilket gör det svårt för läkarna att ge rätt behandling till rätt patient vid rätt tidpunkt. I vår studie använde vi antikroppschip för att analysera blodprover från patienter med fyra olika typer av BCL, mantelcellslymfom (MCL), kronisk lymfocytisk leukemi (KLL), follikulärt lymfom (FL) och diffust storcelligt B-cellslymfom (DLBCL). Vår förhoppning var att hitta biomarkörer som kunde förklara heterogeniteten på proteinnivå. Vi kunde bekräfta att de olika typerna av BCL var mycket heterogena även på proteinnivå och identifiera proteinmönster som delade upp dem i subtyper. För DLBCL kunde vi även koppla uppdelningen till överlevnad, då det visade sig att patienterna i den ena subgruppen löpte större risk att avlida inom en kortare tidsram. DLBCL, som även studerades i artikel III, är en av de vanligaste och mest aggressiva typerna av BCL, men kan också i många fall botas. Sjukdomen, som drabbar ca 500 personer i Sverige årligen, är extremt heterogen, och att avgöra vilka patienter som har sämre prognos och vilka som har bättre är mycket svårt. I förhoppningen att hitta biomarkörer som kunde relateras till prognos analyserades blodprover som samlats från samma patienter vid tre olika tidpunkter från diagnos och genom behandling. Vi jämförde sedan resultaten mellan de olika tidpunkterna med avseende på bl.a. vilka patienter som fick en förvärrad sjukdom. Vi kunde då identifiera ett proteinmönster som skiljde de patienter som fick en förvärrad sjukdom från dem som inte fick det. Vi kunde även upprepa den uppdelning av patienterna efter överlevnad som vi sett i artikel II, och identifiera två proteiner som förbättrade det nuvarande standardmåttet på prognos. Resultaten skulle i förlängningen kunna användas som biomarkörer för prognos, men kan även ge insikt i de biologiska processerna kring DLBCL. I den sista artikeln, artikel IV, användes antikroppschipen för analys av blodprover lämnade av människor som senare drabbades av bröstcancer, för att försöka utröna vad som händer i kroppen i de tidigaste faserna av cancern. Bröstcancer drabbar drygt 8000 svenskar varje år, och är den enskilt vanligaste cancerformen bland kvinnor. Överlevnaden har ökat dramatiskt de senaste årtiondena, till följd av bättre behandlingar och tidigare diagnostik, varför studier på de tidigaste faserna av brötcancer är essentiella. Då vi jämförde blodproverna från de personer som drabbades av bröstcancer med proverna från dem som förblev friska kunde vi identifiera flera proteiner som var associerade med bröstcancer, både sådana som var kända sedan tidigare och nya proteiner. Eftersom de antikroppar vi använder mestadels binder proteiner som är involverade i vårt immunförsvar, kunde vi använda antalet proteiner som var associerade med bröstcancer som ett mått på aktiviteten av immunförsvaret då provet hade tagits. Baserat på detta indikerade resultaten att kroppen genomgår tre faser då cancern utvecklas; a) en elimineringsfas, då kroppens immunförsvar är mycket aktivt i att kämpa mot och eliminera cancern, b) en jämviktsfas, då cancercellerna börjar anamma strategier för att undgå immunförsvaret, och c) en flyktfas, då cancercellerna lyckas undfly immunförsvaret och kan växa okontrollerat, vilket leder till de första sjukdomssymtomen och så småningom diagnos. Med hjälp av denna förståelse av cancerns tidiga utveckling, är förhoppningen att i förlängningen kunna hitta biomarkörer som kan användas för ännu tidigare diagnostik än hittills möjligt. Sammanfattningsvis har arbetet i denna avhandling dels syftat till att vidareutveckla den teknikplattform vi arbetar med, men framförallt varit inriktad på att tillämpa vår teknik för att söka efter biomarkörer i olika typer av cancer. I förlängningen kan detta och fortsatta arbeten förhoppningsvis leda till en ökad förståelse av cancern, och bättre verktyg för diagnos, prognos och val av behandling för cancerpatienter.