Short- and long-term effects of long-chain free fatty acids on pancreatic α- and β-cell function

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Kroppens blodglukoskoncentration regleras av celler i de Langerhanska öarna i bukspottkörteln. β (beta)-celler frisätter insulin då sockerhalten i blodet ökar, tex efter en måltid. Insulin verkar via speciella membranbundna proteiner (receptorer) på celler i muskel, hjärta och fettväv och påverkar dessa att ta upp glukos från blodet. När blodsockerhalten sjunker, t.ex. mellan måltider eller när behovet av energi ökar, så som vid fysisk träning, frisätts istället hormonet glukagon från α (alfa)-celler i öarna. Glukagon har motsatt effekt till insulin och påverkar levern att frisätta glukos till blodet samt att öka glukosproduktionen. Medan insulin är det enda hormon som styr upptag av glukos i olika vävnader, så regleras frisättning av glukos från levern även av adrenalin, ett hormon som frisätts från binjuren vid ökat energibehov. Frisättningen av insulin och glukagon kan dock påverkas av annat än glukos, t.ex. av fria fettsyror. Fria fettsyror finns i vår blodcirkulation och nivån av dessa speglar dels upptag av fett från den mat vi äter, dels mobilisering av fria fettsyror från adipocyter, fettlagrande celler som är specialiserade för detta ändamål. Ett flertal vetenskapliga studier har visat att fria fettsyror, då de tillsätts akut, ökar frisättningen av insulin och att de till och med är essentiella för att β-cellerna ska fungera normalt. Fria fettsyror är således signalmolekyler av fysiologiskt viktig betydelse och dessutom nödvändiga för upprätthållande av en normal insulinfrisättning. Å andra sidan medför kronisk exponering av β-celler för fria fettsyror skadliga effekter och leder till minskad glukosstimulerad insulinfrisättning samt celldöd. Generellt anses mättade fettsyror, som framför allt finns i animaliskt fett, vara mer skadliga än omättade fettsyror, i första hand funna i vegetabilisk föda. De skadliga effekterna av fria fettsyror är av stort intresse då höga blodfettshalter är starkt förknippat med typ-2 diabetes, också kallat åldersdiabetes. Mer än 80 % av alla med typ-2 diabetes är överviktiga och har höga blodfettshalter. Typ-2 diabetes karakteriseras dels av en oförmåga hos muskel-, hjärt- och fettceller att svara på insulinsignaler och dessa vävnader förlorar därmed sin förmåga att i tillräcklig utsträckning ta upp glukos vilket resulterar i en förhöjd blodsockernivå. Typ-2 diabetes utvecklas dock inte så länge β-cellerna fungerar normalt och kan kompensera för det ökade insulinbehovet. Inte förrän β-cellernas funktion störs och ökad insulinfrisättning inte längre kan kompensera för det ökade behovet, utvecklas typ-2 diabetes. Typ-2 diabetes karakteriseras dock inte enbart av en minskad insulinfrisättning utan även av förhöjd glukagonfrisättning. Blodglukagonnivåerna är höga trots den höga glukoskoncentrationen och dessutom frisätts inte mer glukagon då blodsockerhalten sjunker. Det sistnämnda är mycket allvarligt då celler i hjärnan är totalt beroende av glukos för att fungera och en för låg blodsockernivå kan därför leda till koma och död. Effekter av fria fettsyror på α- celler är ett i stort outforskat område och de studier som är gjorda visar varierande effekter. Såväl β- som α-celler är elektriskt aktiva och deras hormon frisätts som svar på elektriska signaler som öppnar eller stänger så kallade jonkanaler i cellmembranet. Jonkanaler är vattenfyllda porer och olika jonkanaler släpper igenom olika typer av joner så som tex kalium (K+) eller kalcium (Ca2+). Joner kan endast passera cellmembranet genom dessa speciella kanaler och det finns dessutom jonpumpar som återställer koncentrationer av jonerna på ut- och insidan av cellmembranet. Eftersom alla joner bär en elektrisk laddning (positiv eller negativ) leder de olika koncentrationerna till att en elektrisk spänning byggs upp över cellmembranet. All hormonfrisättning från de Langerhanska öarna styrs av denna elektriska spänning och förändringar av denna som i sin tur påverkar jonkanalerna att öppnas eller stängas. Det finns dock jonkanaler som regleras av annat än spänningsförändringar. En sådan mycket viktig kanal, i framför allt β-celler, är en speciell kaliumkanal (KATP kanalen) som kopplar en ökning av glukoskoncentrationen till ökad insulinfrisättning. Då blodsockerhalten ökar tas glukos upp av β-cellerna och metabolism av sockret leder till ökad produktion av den energirika molekylen ATP. En liten del av cellens ATP binder till och stänger KATP kanaler i cellmembranet med påföljande förändring av membranspänningen mot mer positiva värden. Denna så kallade depolarisering öppnar de spänningskänsliga Ca2+ kanalerna och inflödet av Ca2+ joner leder till insulinfrisättning. Glukagonfrisättning från α-celler regleras med liknande, något mer komplicerade, mekanismer. Den elektriska regleringen av celler, och därmed indirekt kontrollen av hormonfrisättning, kan studeras med en metod som heter "patch-clampmetoden". I denna metod sugs cellen som ska undersökas fast på en liten vätskefylld glaspipett och två elektroder, en inuti pipetten och en i den omgivande lösningen, kopplade till en förstärkare, bildar en sluten elektrisk krets. Via förstärkaren kan antingen spänningen bestämmas (klampas) och de jonströmmar som uppkommer till följd av detta studeras, eller så styrs strömmarna och spänningsförändringar undersöks. Patch-clamp metoden kan även användas för att indirekt mäta hormonfrisättning. Både insulin och glukagon förvaras i små membranblåsor (granula) inuti cellen och dessa granula smälter, då cellerna stimuleras, samman med cellmembranet och deras innehåll frisätts. Då ett granula smälter samman med membranet ökar storleken av cellens yta och detta kan registreras som en ökning av cellens kapacitans eftersom denna elektriska egenskap är proportionell mot membranytan. Ca2+ är en mycket viktig jon då en ökning av cellens Ca2+-koncentration är den signal som ytterst initierar frisättningen av både insulin och glukagon. Förändringar i cellens Ca2+-koncentration kan studeras med hjälp av Ca2+-känsliga färgämnen som laddas in i cellen och som vid belysning med ljus i speciella våglängder ger fluorescerande signaler. Dessa signaler varierar i styrka beroende av ifall Ca2+-koncentrationen är hög eller låg och effekter av ämnen som påverkar cellernas elektriska egenskaper och därmed den intracellulära Ca2+-koncentrationen kan därigenom studeras. Såväl patch-clampregistreringar som under-sökningar av cellers Ca2+-koncentrationsförändringar är mycket värdefulla metoder för att studera cellfysiologiska skeenden eftersom alla mätningar görs på levande celler och dessa celler kan påverkas under försökets gång, t.ex. genom stimulering med glukos, och omedelbara förändringar studeras. Dessa två metoder är de som främst används i de arbeten som ingår i denna avhandling. I detta avhandlingsarbete har undersökts hur fria fettsyror påverkar funktionen hos såväl α- som β-celler. Det första delarbetet behandlar mekanismer som styr frisättningen av insulin i β-celler och i delarbete II studeras hur dessa mekanismer akut påverkas av den mättade fettsyran palmitat. I delarbete III utökas studien till att omfatta akuta effekter av palmitat på α-cellers funktion och i delarbete IV undersöks slutligen hur en mättad fettsyra, palmitat, och en omättad fettsyra, oleat, påverkar β-cellsfunktionen i ett längre perspektiv. Våra studier visar att palmitat ökar frisättningen av både insulin och glukagon då fettsyran tillsätts akut. I båda celltyper medför stimuleringen en ökning av den intracellulära Ca2+-koncentraionen via stimulerad aktivitet av spänningskänsliga Ca2+-kanaler vilket leder till ökat inflöde av Ca2+-joner. Det är allmänt ansett att effekter av fettsyror på insulinfrisättningen endast uppträder i samband med en hög glukoskoncentration. Vi visar dock att palmitat kan stimulera hormonfrisättning i både α- och β-celler även i frånvaro av en stimulerande glukoskoncentration. Vidare visar vi att palmitat ökar hormonfrisättningen i både α- som β-celler genom att öka antalet granula som finns tillgängliga för Ca2+-stimulerad frisättning. Palmitat, eller en produkt bildad vid metabolism av fettsyran, verkar dessutom stimulera insulinfrisättningen i β-cellerna genom att utöva en direkt effekt på denna granulapool, medan denna mekanism är mindre uttalad i α-cellerna och palmitat främst verkar öka glukagonfrisättningen genom att öka Ca2+-strömmarna. I motsatts till palmitats effekt på α- och β-celler, hämmar fettsyran frisättningen av ett tredje ö-hormon, somatostatin. Somatostatin dämpar normalt frisättningen av insulin och glukagon och en sänkning av somatostatinnivån kan därför förväntas leda till en ökad frisättning av dessa båda hormoner. Medan såväl en låg som hög fettsyrakoncentration stimulerar α-cellsaktiviteten fungerar endast en låg koncentration stimulerande på β-cellerna och en hög fettsyrakoncentration minskar istället Ca2+-strömmarnas storlek. Detta är mycket intressant i ett diabetesperspektiv då höga blodfettshalter i typ-2 diabetes har kopplats till minskad insulinfrisättning. Det är dock riskabelt att dra slutsatser om långtidseffekter baserat på försök som behandlar akuta förlopp och därför utökade vi vår studie till att omfatta långtidseffekter av fettsyror på β-cellsfunktionen. Vi fann att öar odlade i tre dygn i närvaro av antingen palmitat eller oleat tillsammans med en hög glukoskoncentration har en starkt försämrad glukosstimulerad insulinfrisättning samt en något försvagad glukosstimulerad ökning av den intracellulära Ca2+-koncentrationen. Intressant nog verkar inte Ca2+ kanalerna vara påverkade och patch-clampregistreringar visade att dessa kanaler, då cellmembranet depolariseras, snarast har en ökad förmåga att öppnas i fettbehandlade celler. Vi fann däremot att KATP kanalerna var nästan helt stängda även i frånvaro av en stimulerande glukoskoncentration. I frånvaro av glukos genereras normalt inget ATP och KATP kanalerna borde därför vara öppna i denna situation. Våra resultat indikerar därför att fettbehandlade β-cellers elektriska koppling är störd, kanske på grund av att fettbehandlingen leder till generering av en molekyl som stänger KATP kanalerna. Vidare visade morfologiska studier att innehållet av insulingranula var mycket mindre i fettbehandlade celler än i kontrollceller odlade i frånvaro av fett. Mätningar av det totala insulininnehållet visade också att fettbehandlade öar innehåller mindre insulin än kontrollöar. Vi drar därmed slutsatsen att långtidsexponering av β-celler för fetter, såväl mättade som omättade, leder till störda elektriska egenskaper som i sin tur leder till att cellerna då de stimuleras med glukos inte kan generera den signal som normalt leder till insulinfrisättning. Dessutom verkar fettbehandlade β-celler innehålla ett minskat antal insulingranula och mindre insulin, vilket bidrar till den minskade frisättningen av detta hormon. Att utsätta celler för fettsyror under tre dygn kan tyckas vara en mycket kort tid jämfört med den situation som föreligger vid typ-2 diabetes, där blodfettshalterna är förhöjda under flera år. Det faktum att vi ser en toxisk effekt även efter en så kort tid indikerar dock att det finns en stark koppling mellan kronisk exponering för fettsyror och typ-2 diabetes. Eftersom, som redan nämnts, även glukagonfrisättningen är störd vid typ-2 diabetes är det nu av stort intresse att utöka denna långtidsstudie till att även innefatta effekter på α-celler.