Insights into structure and dynamics of the AAA+ motor of magnesium chelatase

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Enzymet magnesium-kelatas katalyserar bildandet av magnesuim-protoporfyrin genom insättning av en magnesiumjon i protoporfyrin. Detta är det första unika steget i tillverkningen av klorofyll hos växter, alger och fotosyntetiska bakterier. Magnesium-kelatas är uppbyggt av tre olika proteiner som kallas I (vikt 40 kDa), D (70 kDa) och H (140 kDa). Tillsammans bildar dessa proteiner ett protein-komplex som är uppbyggt av ett eller flera av respektive protein som samverkar till magnesium-kelatasets enzymatiska aktivitet. Det är samverkan mellan de ingående proteinerna i komplexet som reglerar enzymets funktion. För en fullständig förståelse för den biologiska funktionen krävs det först ingående karakterisering av de enskilda proteinerna som sedan kopplas till sin helhet i det funktionella komplexet. Ett viktigt steg i karakteriseringen är att bestämma proteinernas 3D-struktur, men för att få en fullständig insyn i mekanismen och funktionen behöver man även bestämma 3D-strukturen och dynamiken av det katalytiska komplexet. Exempel på experimentella metoder för strukturbestämning av individuella proteiner eller deras funktionella komplex är t.ex. röntgen-kristallografi, NMR och elektronmikroskopi (EM). För att få en bättre insyn i magnesium-kelatasets biologiska funktion och protein-komplexets strukturella dynamik har främst EM använts, som i kombination med röntgen-kristallografi, bioinformatik, mass-spektrometri och biokemiska analyser, har gett oss helt nya insikter av stor betydelse. Vi visar att I- och D-subenheterna bildar ett 3-faldigt symmetriskt två-delat ring-komplex (s.k. ID-komplex) med en EM rekonstruktion av ID-komplexet i närvaro av substratet ADP, upplöst till 7.5 Å. ID-komplexet tillhör en stor familj av proteiner, de så kallade AAA+ proteinerna. Dessa är biologiska motorer, som behöver ATP för att utföra sin funktion. Spjälkningen (hydrolysen) av ATP inducerar en ändring av konformationen i protein-komplexet, som sedan används som energi av ett AAA+ protein kopplat unikt protein, i katalytisk syfte. I magnesium-kelataset kopplas ID-komplexet till H-subenheten som använder energin till att sätta in magnesium i protoporfyrin. Med hjälp av EM visar vi att ID-komplexet är en ATP driven AAA+ motor, som troligen är beroende av ATP hydrolys för att utföra ändringen av konformationen, vilken är nödvändig före det att H-subenheten associerar och att insättningen av magnesium kan fullföljas. De resultat som presenteras i denna avhandling utökar vår förståelse för magnesium-kelataset och då speciellt ID-komplexet. Med tre olika protein-komponenter och tre inblandade substrat, så står det klart att magnesium-kelatas är en högt utvecklad molekylär maskin som är vida mer komplicerad än vad som någonsin kunnat förväntas.