Studies of a Proteinase-activated Cell Surface Receptor

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Alla levande celler har förmåga att känna av och på olika sätt anpassa sig till sin omgivning, antingen de ensamma utgör en hel organism eller är en av många miljarder celler i ett stort djur. Varje enskild cell kan bara ta emot en begränsat mängd olika sorters signaler och bara reagera på ett likaledes begränsat antal sätt. Den en- eller fåcelliga organismen är därmed genom sin blotta litenhet dömd till en mycket enahanda repertoar av möjliga svar på miljöns krav. Stora djur som människan kan finnas till tack vare att de celler de består av utvecklats till en hög grad av specialisering. En förutsättning är att cellerna kan stå i förbindelse med varandra och tillsammans bilda något annat än bara just en stor hög med celler. Så är också utvecklingshistorien till mer och mer komplicerade livsformer oupplösligt förknippad med utvecklingen av alltmer förfinade medel för kommunikation mellan celler. Samtidigt kan man i studiet av grundläggande signaleringsmekanismer spåra stora djurs släktskap med enklare organismer som till exempel jästsvampar. Receptorer kallas de molekyler som celler har till att ta emot signaler eller känna av förändringar i miljön. Vanligen är receptorer proteiner men kan för övrigt se mycket olika ut och sitta på olika ställen i en cell. En av de vanligaste typerna av receptorer som finns i eukaryota (med cellkärna) celler är de G-proteinkopplade receptorerna. Dessa receptorer är proteiner på 350-800 aminosyror och eftersom de slingrar sig sju gånger genom cellmembranet kallas de ibland sju-transmembran-region-receptorer. G-proteinkopplade receptorer (se figurerna 1 och 2) tar emot signaler på cellens utsida och överför dem på ett tämligen okänt sätt till cellens insida där de aktiverar så kallade G-proteiner. De aktiverade G-proteinerna kopplar sedan vidare till en mängd andra signalsystem inne i cellen (figur 3 och tabell 1). Effekten av stimulering via en G-proteinkopplad receptor kan vara hormonutsöndring, kontraktion, celldelning eller något annat, beroende på vilken sorts cell det är som stimuleras. Uppskattningar säger att det hos till exempel människan finns mer än 1000 olika typer av G-proteinkopplade receptorer och åtminstone tiotals olika typer av G-proteiner. Varje cells svar på en viss signal bestäms därför också av vilken uppsättning av receptorer och G-proteiner som den har. De G-proteinkopplade receptorerna är viktiga för den praktiska medicinen framför allt därför att många mycket flitigt förskrivna läkemedel verkar via sådana receptorer. Beta-blockare för blodtrycksreglering, neuroleptika och antihistaminer för behandling av magsår är bara några exempel ur högen. Ett fåtal genetiska sjukdomar har kopplats till mutationer i arvsanlagen för G-proteinkopplade receptorer. Till exempel har njursjukdomen nefrogen diabetes insipidus knutits till ett fel i receptorn för signalpeptiden vasopressin. Oftast kan symtomen vid dessa genetiska sjukdomar härledas till den skadade receptorns normala signaleringsfunktion. Ett undantag är sjukdomen retinitis pigmentosa, där fel i en typ av ljusreceptor leder till att delar av ögats näthinna långsamt förstörs. Många G-proteinkopplade receptorer är inblandade i signalering till celldelning. Dock har ännu inget fel i någon receptor kunnat kopplas direkt till cancerutveckling. Manuskripten i den här avhandlingen beskriver upptäckten och den inledande karakteriseringen av en tidigare okänd receptor i familjen av G-proteinkopplade receptorer. Från början var det egentligen inte receptorproteinet i sig som vi hittade utan ett DNA-fragment som innehöll delar av arvsanlaget för receptorn. Med molekylärbiologiska tekniker har vi sedan vidare studerat arvsanlagets struktur, hur receptorn fungerar, hur tillverkningen av nya receptorer regleras i levande celler och var i kroppen och på vilka celler de färdiga receptorerna finns uttryckta. Vad det är för en substans som verkar på receptorn är fortfarande okänt men allt talar för att den aktiveras genom att ett proteinklyvande enzym - ett proteinas - tar bort en bit av receptorns extracellulära svans. Eftersom trombinreceptorn är den enda tidigare kända receptor som fungerar på det sättet har vi kallat receptorn för proteinasaktiverad receptor 2 (PAR2). När trombin kluvit bort den yttersta änden på trombinreceptorn är det den "nya" änden som sedan binder till någon annan del av receptorn och aktiverar den (figur 5). Således kan receptorn experimentellt aktiveras med syntetiskt tillverkade korta proteinmolekyler (peptider). Därför har det spekulerats om det möjligen finns naturligt förekommande peptider som verkar via trombinreceptorn. Sannolikt är det inte så för de fria peptiderna binder ganska dåligt till receptorn. PAR2 fungerar likadant som trombinreceptorn. Den kan klyvas (och aktiveras) av trypsin, som är ett mycket ospecifikt enzym men tillhör samma klass av enzymer som trombin - serinproteinaserna. PAR2 kan också aktiveras med peptider som ser ut som receptorns nya ände efter trypsinklyvning. I alla celler som vi testat som uttrycker PAR2 ger aktivering upphov till en ökad intracellulär kalciumkoncentration. I de celler vi studerat noggrannare har vi sett frisättning av inositolfosfater och arakidonsyra, men ingen påverkan på nivåerna av cykliskt AMP. Serinproteinaserna är en stor klass av enzymer. Mest välbekanta är enzymerna i koagulations- och komplementsystemen. Dessutom är det känt att många olika typer av celler i kroppens försvarssystem tillverkar och utsöndrar serinproteinaser. Helt säkert är många ännu inte upptäckta. Det finns alltså många "kandidatenzym" som skulle kunna verka via PAR2. Det svåra med att rena fram det rätta enzymet består främst i att man måste ha en både känslig och mycket specifik metod att mäta enzymaktivitet. Hittills har vi varit begränsade av att vi har måst testa våra enzympreparationer på levande celler som uttrycker PAR2. Så har varje skenbart positivt test vid närmare granskning visat sig bero på olika föroreningar som aktiverat cellerna. Särskilt har föroreningar med trombin varit ett problem. De flesta celler uttrycker trombinreceptorer, vilka uppenbarligen aktiveras av mycket låga koncentrationer trombin. Vi har studerat i vilka kroppsvävnader PAR2 finns uttryckt under fosterutvecklingen hos möss. Framför allt finns receptorn i celler som bildar olika avskiljande ytor - epitel - i kroppen. Särskilt mycket receptor finns i mag-tarmkanalens ytepitel, men också till exempel i huden och i blodkärlens endotel. Därför tror vi att PAR2 har en funktion som hör ihop med någon fundamental epitelegenskap. Kanske är receptorn på något sätt med i regleringen av hur tätt (eller genomsläppligt) epitelet ska vara i olika situationer. Förutom den tydligt epiteliala lokalisationen finns PAR2 under fosterutvecklingen i thymus där T-lymfocyterna mognar ut och i delar av skelettet som just håller på att förbenas. PAR2 finns ingenstans i centrala nervsystemet (hjärna och ryggmärg) utom i ögats näthinna. Generna för PAR2 och trombinreceptorn ligger nära varandra på kromosom 5 (hos människa). Vi håller på att undersöka om det finns fler gener för liknande rceptorer i samma kromosomregion. Slutligen har vi undersökt hur uttrycket av PAR2 förändras i odlade endotelceller (från blodkärlsytan) när cellerna stimuleras med olika substanser. Det intressantaste fyndet var att uttrycket av PAR2 ökade dramatiskt i celler som stimulerats med inflammatoriska signalmolekyler. Ökningen fortsatte under ett dygn med ihållande stimulering och stannade på en hög nivå under flera dagar, så långt vi följde förloppet. Däremot ökade inte uttrycket inte av trombinreceptorn av samma stimulering. Även om PAR2 finns redan i ostimulerade celler tycks uttrycket vara betydligt lägre för den än för trombinreceptorn. Andra har visat att trombinreceptorn troligen har en roll i den tidiga fasen av en inflammatorisk reaktion. Våra resultat tyder på att PAR2 skulle kunna vara viktig i ett senare skede i den akuta inflammationen.