Aspects of proteinase-activated receptor-2: A sensor of enzymatic activity at the cell surface

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Vår kropp består av en till synes oändlig mängd individuella celler. För att alla dessa celler skall kunna fungera som en helhet måste de meddela sig med varandra. För att en cell i tån ska kunna känna av vad som händer i knät så har den bland annat receptorer på sin yta. Receptorer är proteiner som sitter förankrade i cellens yttre skal, i cellmembranet. Receptorns ena del är exponerad mot cellens omgivning medan dess inre del har kontakt med cellens operativa maskineri. Varje receptor är specifik dvs den binder endast en viss typ av molekyl. När rätt molekyl binder till receptorn ändras receptorns form och på så sätt överförs den aktiverande signalen från cellens utsida till dess insida. Genom att olika signalsystem i cellen aktiveras svarar cellen och resultatet kan bli att den drar ihop sig, delar sig eller utsöndrar exempelvis ett hormon. Denna avhandling beskriver en speciell receptor, kallad proteinasaktiverad receptor-2 (PAR-2). Den tillhör en liten familj av receptorer som har förmåga att känna av när proteinklyvande enzymer är aktiva vid cellens yta. Receptorerna är unika så till vida att enzymet inte bara binder till receptorn utan också klyver bort en liten bit i dess yttersta del. Då skapas en "ny" receptorände och det är denna nya ände som binder någonstans i receptorn och därmed aktiverar den. De proteinasaktiverade receptorerna ingår i en stor familj av receptorer som på cellens insida är kopplade till särskilda signalproteiner, de så kallade G- proteinerna, som i sin tur förmedlar signalen till cellens olika delar. De G- proteinkopplade receptorerna är mycket vanliga och trots att de binder molekyler av varierande slag, från mycket stora proteiner till små enskilda joner och till och med fotoner (ljus), så har de en gemensam struktur. De består av en lång kedja aminosyror som slingrar sig sju gånger genom cellmembranet och kallas därför också sju-transmembran-regionreceptorer. När jag påbörjade mitt avhandlingsarbete hade mina blivande kollegor precis upptäckt att PAR-2 fanns. De hade isolerat en bit DNA som innehöll arvsanlaget för PAR-2 och rapporterat upptäckten in en tidskrift. I avhandlingens första delarbete studerar vi hur arvsanlaget för PAR-2 verkligen ser ut. Med hjälp av olika tekniker visar vi att genen som bestämmer utseendet på PAR-2 består av två olika DNA delar (exoner) som sitter åtskilda i arvsmassan. Från början trodde vi att PAR-2 bildades med utgångspunkt från ett enda exon. Upptäckten av ett ytterligare exon ledde till att vi förstod att PAR-2 såg lite annorlunda ut än vi först hade påstått. Det har sedan visats att de övriga tre receptorerna inom familjen har en liknande genstruktur vilket antyder ett gemensamt ursprung. Vi visade att PAR-2 kan aktiveras av trypsin men det är ännu inte känt vilket proteinas som verkligen aktiverar PAR-2 i kroppen. Genom att studera aktivering av PAR-2 i enskilda odlade celler så har man kunnat identifiera ytterligare tre tänkbara aktiverande proteinaser, nämligen tryptas från mastceller samt två olika proteinaser som medverkar till blodkoagulationen, faktor VIIa och faktor Xa. Att studera receptoraktivering i celler har visat sig vara svårt eftersom man riskerar att få falska positiva svar, särskilt om man söker ett proteinas i en komplex blandning. I delarbete tre presenterar vi en ny metod att studera aktivering av PAR-2. Vi modifierade PAR-2 på så vis att vi förlängde receptorns yttersta del med fler aminosyror. När den modifierade receptorn klyvs och aktiveras lossnar den yttersta delen och med hjälp av den förlängda biten kan vi direkt mäta hur många receptorer som kluvits. Vi jämförde om tryptas och trypsin kan aktivera PAR-2 lika effektivt och fann att trypsin fungerar bättre än tryptas. När vi undersökte effekterna av PAR-2 aktivering i olika typer av celler fann vi stimulering av de signalvägar som leder till ökade kalciumnivåer i cellen.Vi fann också att aktivering av PAR-2 leder till frisättning av prostaglandiner som påverkar omkringliggande celler. I delarbete två, undersöker vi om PAR-2 aktivering kan leda till mer långtgående cellulära effekter dvs om cellens utseende (fenotyp) förändras. Vi studerade endotelceller isolerade från ytan på blodkärl och fann att aktivering av PAR- 2 ökar mängden tissue factor på cellernas yta. Tissue factor är ett protein som spelar en viktig roll när blodet koagulerar och således leder aktivering av PAR-2 till att endotelcellen förändras från sitt vanliga antikoagulanta jag till att bli mer prokoagulant. I det fjärde delarbetet har vi studerat förekomsten av PAR-2 i livmoder- slemhinnan hos kvinnor i fertil ålder. Under varje menstruationscykel genomgår slemhinnan en intensiv uppbyggnads- och mognadsprocess. Om inget befruktat ägg fastnar och en graviditet påbörjas förstörs slemhinnan och stöts ut i samband med menstruationsblödningen. De cykliska förändringarna i slemhinnan är förknippade med enzymatisk aktivitet och vi spekulerade att kanske PAR-2 utgör en del av processen. Vi fann att PAR-2 finns i blodkärlen under hela menstruationscykeln. Dessutom fann vi att ytcellerna (epitelet) börjar bilda PAR-2 i samband med ägglossningen och fortsätter bilda PAR-2 ända fram till menstruationen. Det betyder att när ett eventuellt befruktat ägg fastnar på slemhinnans yta kan PAR-2 möjligen aktiveras av de proteinaser som frisätts vid infästningen. Om däremot ingen befruktning sker, inleds så småningom en för slemhinnan destruktiv process med många inflammatoriska likheter. Då frisätts en rad olika proteinaser varav ett eller flera kan tänkas aktivera PAR-2. Resultaten från våra och andra forskargruppers experiment tyder på att PAR-2 kan medverka vid inflammation men eftersom det ännu inte är känt vilket proteinas som verkligen aktiverar PAR-2 är det än så länge svårt att definiera en mer exakt roll.