The collagen fibrillar network: Sequential degradation of its constituents by tissue metalloproteinases

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Brosk bekläder våra leder och förser dem med en slät yta vilket förhindrar en direkt ben mot ben kontakt. Det fungerar också som stötdämpare i belastade leder och ger glidytan mycket låg friktion. Vatten hålls kvar i broskets matrix på grund av den negativt laddade proteogykanen Aggrecan vilken i sin tur hålls kvar i ett nätverk av kollagenfibrer. När en led belastas pressas vätska ut och när belastningen försvinner sväller det igen på grund av Aggrecans förmåga att attrahera vatten. Kollagenfibrerena är uppbyggda av en mängd enskilda molekyler. I brosk består det huvudsakligen av kollagen typ II, en trippel-helix molekyl som interagerar och bildar fibrer. Kollagen typ IX bekläder fibrerna till vilka de är kovalent bundna. Decorin och Fibromodulin tillhör en annan proteinfamilj, de så kallade ”small leucine rich repeat proteins” och binder även de till kollagen typ II. De är kända för att vara viktiga för en korrekt fiber formering och finns kvar i matrix med en hittills okänd funktion. En möjlig funktion är att de binder till och skyddar fibrerna från proteolytiska enzym såsom matrix metalloproteinaser. Denna familj av proteinnedbrytande enzym är ingående studerad och dess aktivitet är knuten till brosknedbrytning både in vitro och in vivo. I friskt brosk, degraderas uttröttade molekyler av proteolytiska enzym producerade av broskcellerna och förnyas genom nysyntes från samma celler. Denna process är i balans vilket medför att mängden brosk inte förändras signifikant. Vid ledsjukdom är den metabola balansen störd. Den enzymatiska nedbrytning är större än nybildningen av matrixmolekyler. Om denna process fortgår förloras alltmer broskvävnad. Resultatet blir att ett funktionellt matrix inte kan upprätthållas och att broskets stötdämpande funktion försämras. Degradation av matrix verkar uppstå som en sekvens av händelser där förlust av en sorts byggsten (molekyl) sker före förlust en av en annan. Leddestruktion börjar med nedbrytning av Aggrecan och fortsätter med nedbrytning av Kollagen typ II, vilket dock sker sent i förloppet. Förlusten av Aggrecan som ses vid reaktiv artrit är reversibel utan bestående konsekvenser för vävnaden och patienten. Skador som påverkar kollagennätverket ses däremot som bestående och möjlighet till reparation liten. Nedbrytning av broskmatrix är så komplex att förändring av en enskild markör inte räcker för att fastställa sjukdomsstatus hos en patient. Däremot kommer i framtiden en panel av markörer att möjliggöra detta. Arbetet som presenteras i denna avhandling har som mål att öka förståelsen av händelseförloppet av brosknedbrytning i sjukdommar som reumatoid artrit och artros. Vi har arbetat med att utveckla detektion av broskmatrix specifika degradationsprodukter. Utvecklandet av två sådana markörer beskrivs, en är en markör av ett sent skede i sjukdomsförloppet (Kollagen typ II), medan den andra (Fibromodulin) tros representera ett tidigare skede. Proteolys av Kollagen typ II börjar med en definierad klyvning i trippelhelixen genom Kollagenaser (MMP-1, 3, 8, 13 and 14). Den kluvna molekylen vecklas därefter upp och degraderas ytterligare. Markören för degraderat kollagen typ II som utvecklades i detta arbete detekterar enbart kollagen som är klyvt och som inte längre föreligger som trippelhelix. Ökad mängd av fragmentet detekterades i brosk från artrospatienter i jämförelse med brosk från patienter utan artros. Arbetet med markören av tidig broskdegradation (Fibromodulin) har utvecklats till följande nivå: nedbrytningspodukten av Fibromodulin har identifierats vid odling av broskexplantat under degenerativa förhållande. Degradation av Fibromodulin i lösning med framrenade enzym visar att samma klyvningsprodukt bildas av matrix metalloproteinase 13. Klyvningsprodukten av humant fibromodulin var densamma under dessa förhållande. En antikropp framställdes som specifikt reagerar med degradationsprodukten. Den visade sig dock inte fungera optimalt i en kvantitativ assay. Därför undersökte vi den N-terminala delen av Fibromodulin för att fastställa strukturen och eventuell posttransationell modifiering. Både veckning (struktur) och posttransationell modifiering skulle kunna förklara varför anitkroppen inte var tillräcligt kraftfull för kvantifiering. Den första del vi karakteriserade var den N-terminala cysteinloopen. Cystein bindning inom en molekyl är nödvändig för proteiners konformation. Vi fann att de fyra cysteinerna i den N-terminala delen var formerades som en korsad dubbelloop. Det kan spekuleras att den epitop som vi är intesserade av är gömd mellan de två lopperna med följden att steriskt hindra antikroppsinbindningen. Tyrosinsulfatering är en modifikation som uppträder på en del utsöndrade protein där det finns anhopningar sura aminosyror. Fibromodulin har denna typ av modifiering i sin N-terminala del. De exakta positionerna är inte kända. Vi har kartlagt deras possition med masspektrometri. Tyrosinerna i den epitop vi är intresserade av visade sig vara sulfaterade. Antikroppen som vi tillverkade var gjord mot en osulfaterad peptid vilket kan förklara varför den inte fungerade i ELISA-assay. En ökad möjlighet till kvantifiering av degradationsprodukter kan förbättra möjligheten för en tidig diagnos av ledsjukdommar. Vårt arbete beskriver utvecklandet av två potentiella markörer för proteolytisk nedbryning av broskets matrixmolekyler. Vi har också funnit att matrix metallaoproteinas 13 klyver fibromodulin på samma ställe som vi fann vid odling av broskexplantat. Detta är samma proteas som troligen degraderar kollagen i de sena skedet av ledsjukdom. Ökad kunskap om vilka proteaser som klyver matrixmolekyler vid ledsjukdom kan leda till utveckling av specifika hämmare av desamma.