Mitochondrial permeability transition following calcium overload. - Its role in neuronal cell death and potential as a pharmacological target

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Hjärnan är ett energikrävande organ och förbrukar ca 20% av blodets syre trots att den bara utgör 1-2% av kroppsvikten. Mitokondrien är den del av cellen där syre och näringsämnen förbränns till koldioxid och vatten, och mitokondrien kallas ofta för cellens kraftstation. Denna process, den så kallade cellandningen, är kopplad till produktion av den energirika molekylen ATP som sedan används till energikrävande processer i cellen. Mitokondriens inre delar (dess matrix) omsluts av ett inre veckat lipidmembran. Detta omsluts i sin tur av ett yttre lipidmembran (Fig 1.). Det yttre membranet innehåller många porer som släpper igenom små molekyler, medan innermembranet är helt tätt, eller impermeabelt, för vattenlösliga molekyler. Cellandningen, eller respirationen, i mitokondrien är en komplicerad process och den kräver just ett impermeabelt innermembran för att fungera. Näringsämnen bryts successivt ned i cellen till mindre beståndsdelar och i mitokondrien används den energi som finns lagrad i näringsämnena till att pumpa ut vätejoner (protoner) från mitokondriens matrix till utrymmet mellan inner- och yttermembranet. Eftersom innermembranet inte släpper igenom protoner leder detta till en skillnad i protonkoncentration (pH) över innermembranet, men också till en spänningsskillnad på grund av att protoner är laddade partiklar. Sammantaget utgör pH-skillnaden och spänningen en protondrivande kraft. Utpumpningen av protoner kan liknas vid en generator som alstrar kraft till en elektrisk krets. Den elektriska kraften i en krets kan användas för olika ändamål, t.ex. till att driva en motor. I mitokondrien används den protondrivande kraften främst för att omvandla molekylen ADP till ATP. Hjärnans celler kräver mycket ATP för att kunna fungera. En störning av mitokondriernas normala funktioner kan därför leda till att cellerna de finns i skadas eller dör. En allvarlig störning som kan leda till celldöd är mitokondriens permeabilitets-transition (mPT). Liksom namnet antyder innebär mPT en övergång, eller transition, från mitokondriens normala impermeabilitet till en plötslig permeabilitet, d.v.s. flera molekyler som normalt inte kan passera över mitokondriens innermembran kan plötsligt flöda fritt, däribland protoner. Liksom en kortslutning av en elektrisk krets, innebär mPT att den protondrivande kraften och därmed ATP-bildningen helt upphör. Eftersom mitokondriens matrix innehåller väldigt mycket proteiner leder också mPT till att vatten flödar in osmotiskt och att mitokondrien svullnar. Mitokondrien har också en viktig funktion i att buffra kalcium (Ca2+). Kalciumkoncentrationen inne i cellen är normalt väldigt låg, ca 10000 gånger lägre än koncentrationen utanför cellen, och tillfälliga höjningar kan aktivera flera olika processer. Kalcium är därför en viktig signalmolekyl som kan styra olika funktioner i cellen. För höga eller långvariga kalciumökningar kan dock vara mycket farligt för cellen, och då spelar mitokondriens förmåga att ta upp och lagra kalcium en viktig roll. I normala fall har mitokondrien stor kapacitet att lagra kalcium, men under situationer då t.ex. cellens energistatus är försämrat sjunker mitokondriens kapacitet att lagra kalcium och kalcium kan då istället orsaka att mitokondrien genomgår mPT. Medicinen cyclosporin A (CsA) förhindrar mPT genom att binda till proteinet cyclophilin D (CypD) i mitokondrien. CypD katalyserar en omvandling i mitokondriens innermembran som leder till mPT, och genom att hämma CypD kan CsA motverka att mitokondrien genomgår mPT. CsA har flera effekter i människokroppen och används idag för ett helt annat ändamål, nämligen immunförsvarshämning så att det t.ex. är möjligt att transplantera in främmande organ utan att de stöts bort. Om CsA kommer in i hjärnan är det kraftigt skyddande mot flera typer av hjärnskador. I djurförsök minskar t.ex. CsA den skada som orsakas efter att blodtillförseln tillfälligt stoppas till hela eller delar av hjärnan (så som sker vid stroke) eller efter de tryck och krosskador som sker vid en traumatisk hjärnskada. CsA har också visats förlänga överlevnaden i möss som har en neurodegenerativ sjukdom liknande ALS (amyotrofisk lateral skleros). Mycket av arbetet i denna avhandling bygger på hypotesen att den skyddande effekten av CsA vid olika hjärnskador delvis eller helt beror på förhindrandet av mPT. En del tidigare arbete har dock ifrågasatt att mPT verkligen finns eller har relevans i hjärnans mitokondrier eller att CsA har någon skyddande effekt. I de två första delarbetena undersökte vi om framrenade mitokondrier från hjärnvävnad genomgår mPT när de blir exponerade för kalcium. Vi undersökte dels mitokondrier vars cellandning var avstängd och där kalcium har en relativt direkt effekt på de molekylära strukturer som ligger bakom mPT, och dels respirerande mitokondrier som gavs näringsämnen och aktivt tog upp och buffrade kalcium. Under båda situationerna svullnade mitokondrierna till följd av kalcium vilket tyder på att de genomgick mPT. Svullnaden var beroende av dosen av kalcium, men då mitokondrierna svullnade var responsen genomgående d.v.s. det tycktes inte finnas några olika undergrupper av mitokondrier som svarade fundamentalt olika på kalcium. I respirerande mitokondrier kunde svullnaden avbrytas genom att binda upp givet kalcium, och mitokondrierna återfick då till stor del sitt tidigare utseende och sin spänning över innermembranet. CsA var kraftfullt skyddande mot mPT i mitokondrier vars cellandning var avstängd, och hade en liknande effekt i respirerande mitokondrier om ADP var närvarande. Om ADP inte tillsattes hade CsA en mindre effekt mot kalciuminducerad svullnad, men hade desto större effekt på att förbättra återhämtningen hos mitokondrier där kalcium bands upp. Slutsatserna från de första arbetena var att hjärnmitokondrier generellt kan genomgå mPT och att CsA utövar en skyddande verkan mot mPT. För att bättre kunna utvärdera om effekten av CsA i djurförsök beror på förhindrandet av mPT eller inte vore det önskvärt med mer specifika mPT-hämmare. För behandling av människor mot hjärnskador kan den immunförsvarshämmande effekten av CsA anses vara en biverkan. I det tredje delarbetet utvärderade vi två cyclosporinvarianter, NIM811 och UNIL025 (eller Debio-025), med hjälp av de metoder vi använde i de två första studierna. Både NIM811 och UNIL025 saknar immunförsvarshämmande verkan men är i övrigt strukturellt lika CsA. Vi fann att båda molekylerna förhindrade mPT på liknande sätt som CsA. Båda, men framför allt UNIL025, var också mer potenta än CsA, d.v.s. de förhindrade mPT vid lägre doser än CsA. Slutsatsen från det tredje delarbetet var att dessa molekyler är lovande farmaka både experimentellt för att bättre kunna undersöka mPT i celldödsprocesser men också förhoppningsvis som mer specifika läkemedel med mindre biverkningar hos människor. Upphörd energiproduktion från mitokondrier kan uppenbarligen skada en cell om den blir omfattande. En ytterligare orsak till att mitokondrien kan orsaka cellskada och celldöd tros vara genom produktion av reaktiva syreprodukter (begreppet fria radikaler används ofta som synonym). Eftersom syrgasomvandlingen sker i mitokondrien kan också reaktiva syreprodukter bildas här. Mitokondrien har dock också kraftfulla avgiftningssystem, och om mitokondrien under normala förhållanden verkligen producerar en större mängd reaktiva syreprodukter som kan skada cellen är omtvistat. Det har dock föreslagits att kalcium kan orsaka ökad produktion av reaktiva syreprodukter. I det fjärde delarbetet visade vi att mitokondrien genererar mer reaktiva syreprodukter efter att den genomgått mPT. Kalcium i sig utan att mitokondrien genomgick mPT hade dock ingen ökande effekt. Eftersom den protondrivande kraften upphör när mitokondrien genomgår mPT försvinner också mycket av drivkraften för att generera reaktiva syreprodukter. Å andra sidan försvinner också en viktig del av avgiftningssystemet eftersom detta också är beroende av den protondrivande kraften. Slutresultatet blir att nettoproduktionen av reaktiva syreprodukter ökar och detta kan i sin tur leda till ytterligare skada i cellen. I arbetet testade vi också ett tjugotal cyclosporin-analoger och fann att deras förmåga att förhindra kalciuminducerad svullnad korrelerade med förmågan att förhindra kalciuminducerad produktion av reaktiva syreprodukter. Mitokondrier isolerade från mänsklig levervävnad uppvisade också liknade resultat som mitokondrier från råttlever och hjärna. Slutsatsen från fjärde delarbetet var att mPT är en situation då mitokondrier kan generera patologiska nivåer av reaktiva syreprodukter. I de tidigare arbetena gav vi kalcium som en enstaka stor dos för att se om mitokondrierna genomgick mPT. I femte delarbetet gav vi istället kalcium som en långsam infusion. Därmed kunde vi noggrannare följa hur mitokondrierna klarade av att buffra kalcium. Genom att vid infusion av kalcium dels titta på hur mitokondrierna behåller kalcium och dels se hur de förbrukar syrgas kunde vi se att det som begränsar mitokondriens förmåga att buffra kalcium verkligen är mPT. En viktig observation var dock att det som reglerar mPT inte nödvändigtvis behöver ha en motsvarande effekt i hur mycket kalcium mitokondrien klarar av att buffra. Det som aktiverar mPT är fritt kalcium inne i mitokondrien, men när mitokondrien aktivt tar upp kalcium binder den upp det mesta i komplex med fosfat och det blir därmed inaktivt. Det som ligger bakom att mitokondrien kan binda upp kalcium är dess basiska miljö (högt pH). Detta står i motsats till regleringen av mPT i sig. I studier av hur mPT aktiveras när kalciumupptag är avstängt har en sur miljö (lågt pH) visat sig vara skyddande. Det som troligtvis är viktigast i kroppen är kombinationen av dessa effekter och då finner vi att betydelsen av komplexbildningen av kalcium överväger. I det femte delarbetet finner vi nämligen att ett basiskt matrix är väsentligt för att hjärnmitokondrier ska kunna binda upp kalcium och undvika mPT. Mitokondriens innermembran är också i normala fall impermeabelt för kalium (K+) som finns i hög koncentration inne i cellen. Det har dock föreslagits att en typ av kaliumkanaler (mitoKATP) finns i mitokondrien och att de kan öppnas vid kortvariga blodflödesrubbningar. Dessa kanaler ger ett läckage av kalium in till mitokondriens matrix och det tros kunna skydda mitokondrierna vid nya episoder av blodflödesbrist, även om mekanismen för den skyddande effekten är okänd. Vi finner att om vi ökar läckaget av kalium med hjälp av en kemikalie som transporterar kalium ökar hjärnmitokondriers förmåga att buffra kalcium (Ca2+). Detta tror vi beror på att matrix blir ytterligare basiskt p.g.a. en kompensationsmekanism för kaliumläckaget. Genom att göra matrix mer basiskt hålls nivån av fritt kalcium lågt och därmed minskas också risken att mPT aktiveras. Mitokondrien har även en viktig roll i de celldödsprocesser som är nödvändiga under t.ex. utvecklingen av hjärnan eller i organ där celler byts ut. Denna typ av celldöd innebär en ordnad sorti som sker utan att orsaka störningar kring den döende cellen. Denna process brukar kallas för programmerad celldöd eller apoptos. Mellan mitokondriens membran finns flera celldödsaktiverande proteiner. När de finns i mitokondrien är de antingen inaktiva eller har en annan funktion. Om de däremot läcker ut i resten av cellen, aktiverar de celldödsprogram som successivt bryter ned cellen. Vid aktivering av mPT och den svullnad som följer kan mitokondriens yttermembran spricka och dessa celldödsproteiner läcka ut. Men det finns andra mekanismer som kan orsaka att dessa proteiner läcker ut, och det har varit mycket omdebatterat vilken roll mPT kan ha i programmerad celldöd. Eftersom denna typ av celldöd är aktiv och kräver en bevarad energiproduktion kan inte alla mitokondrier genomgå mPT. Då blir följden istället att cellen förlorar sin intakta struktur och miljö, med följd att dess innehåll läcker ut och orsakar inflammation. Denna celldöd kallas för nekros. I celldödsprocesser som utvecklas efter akuta hjärnskador ser celldöden varken ut som nekros eller apoptos. Man kan tänka sig att en tillfällig mPT och svullnad av mitokondrien, så som den vi visar i andra delarbetet, eller mPT begränsat till en liten del av cellens mitokondrier kan starta långsammare celldödsprocesser som har inslag av energibrist, ökad produktion av reaktiva syreprodukter men även utsläpp av dödsproteiner. Dock tycks inte den rena formen av programmerad celldöd involvera mPT. Studier med läkemedel såsom CsA tyder på att mPT kan spela en viktig roll för hur celldöden utvecklas efter flera typer av akuta hjärnskador men även en del kroniska. Skadan kan därmed begränsas om man ger läkemedel som hämmar aktiveringen av mPT. Med hjälp av genetiskt modifierade djur som saknar CypD har man också kunnat bekräfta att mPT är ansvarig för mycket av den hjärnskada som utvecklas i en djurmodell som efterliknar stroke hos människor. Användning av CsA eller dess mer specifika analoger begränsas dock för närvarande av att de inte på ett enkelt sätt passerar in i hjärnan. Vid traumatisk hjärnskada är dock den barriär som håller CsA utanför hjärnvävnaden skadad och kliniska prövningar i människor har påbörjats för att undersöka om CsA kan hjälpa dessa patienter. Även vid den neurodegenerativa sjukdomen ALS planeras CsA att ges direkt in till centrala nervsystemet i hopp om att minska sjukdomstakten.