The Enteric Nervous System, Plasticity and Survival

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Bakgrund. Det enteriska nervsystemet (ENS) — mag-tarmkanalens eget nervsystem betraktades tidigare i stor utsträckning enbart som en passiv omkopplingscentral inom det parasympatiska nervsystemet. Forskningsresultat från det senaste decenniet har emellertid gett oss ett helt nytt synsätt. ENS ― ibland refererat till som ‘The second brain’ ― uppvisar trots tillhörighet till det autonoma nervsystemet stora likheter med det centrala nervsystemet (CNS). Detta avspeglas i ENS komplexa uppbyggnad och funktion, samt dess förmåga att utföra integrerade reflexer oberoende av CNS ― i avsikt att kontrollera peristaltik, sekretion, blodflöde och tillväxt. ENS betydelse för upprätthållande av tarmens olika aktiviteter har genererat hypotesen att det, i analogi med CNS, är adaptativt. En defekt utveckling av ENS, olika nervskador och/eller neurodegeneration tros kunna orsaka funktionella tarmrubbningar. En rad faktorer av betydelse för ENS utveckling har identifierats, men vår kunskap om vilka substanser som är nödvändiga för upprätthållande, adaptation och överlevnad av det adulta ENS är fortsatt otillräcklig. Ett exempel på en defekt i ENS är Hirschsprung's sjukdom (HSCR). Vid denna saknas nervceller i tarmväggen (aganglionos) ― i ett varierande långt distalt segment. Sjukdomen leder till en funktionell obstruktion av den afficierade tarmen, beroende på bland annat en avsaknad av den icke-adrenerga/icke-kolinerga inhibitoriska innervationen. Sjukdomen drabbar ca 1 av 5000 levande födda barn. De senaste åren har ett stort antal arbeten publicerats kring den genetiska bakgrunden till HSCR och ett flertal bakomliggande mutationer beskrivits. De påvisade genetiska defekterna indikerar möjligheten att det föreligger en mer generell rubbning i ENS. Detta kan även misstänkas kliniskt då en del barn uppvisar dysmotilitetstillstånd trots resektion av det aganglionära tarmsegmentet. En förändrad ‘mikromiljö’ har beskrivits i aganglionär tarm, där exempelvis en ökad halt av laminin förmodas orsaka en för tidig utmognad av neuroblaster och/eller ett hinder för dessas migration under fetalperioden. Ett flertal djurmodeller finns tillgängliga för studier av aganglionos. I den här studien användes lethal spotted (ls)-möss ― genetiskt definierade av en mutation i endotelin-3-genen, vilken leder till en avsaknad av ganglieceller i rektum hos de homozygota mössen. Syfte. Syftet med avhandlingen var att studera plasticitet (fr a förändring i uttryck av neurotransmittorer) och överlevnad av adulta enteriska neuron. I delarbete I-III studerades ENS och interstitiella Cajalceller (ICC) hos ls-möss. I delarbete IV utvecklades och utvärderades två modeller för primärkultur av adulta myenteriska neuron från råttans tunntarm. I delarbete V och VI studerades överlevnad av adulta myenteriska neuron i odling, och möjliga neurotrofa effekter av vasoaktivt intestinalt peptid (VIP), kväveoxid (NO) och pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP). Huruvida antalet neuron innehållande VIP, NOS eller PACAP förändrades under odling utvärderades. Resultat och diskussion. Utgör ls-möss en användbar modell för studier av HSCR? Rektum hos de homozygota mössen uppvisade genomgående en aganglionos. Därutöver noterades överensstämmelse både avseende morfologi och funktion mellan ls-mössens rektum med tidigare undersökningar på aganglionära tarmpreparat från patienter med HSCR. Tillsammans indikerar dessa resultat att ls-mössen utgör en lämplig modell för fortsatta studier avseende patogenes av intestinal dysmotilitet, inkluderande farmakologiska och interventionella studier ― exempelvis transplantation av enteriska neuron (delarbete I). Skillnader i ENS och ICC är inte begränsade till aganglionär tarm hos ls-möss. I delarbete II sågs avvikelser i det totala antalet neuron, samt för uttrycket av olika neuropeptider och kväveoxidsyntetas (NOS) i tarm proximalt om det aganglionära segmentet hos homozygota (rektumaganglionos) jämfört med heterozygota ls-möss (friska kontroller). Därutöver kunde en reduktion av ICC påvisas i distala kolon och rektum hos homozygota ls-möss jämfört med friska kontroller. Dessa celler anses viktiga för ‘slow wave activity’ i tarmens muskulatur, och utgör en länk mellan neuron och glatta muskelceller. Skillnader i antal neuron, uttryck för neurotransmittorer och distribution av ICC torde kunna utgöra ett morfologiskt underlag som förklaring till dysmotilitet i ganglionär tarm, som till exempel hos barn med HSCR. De aktuella resultaten pekar på betydelsen att studera även andra regioner av tarmen än det aganglionära segmentet. Överlevnad av myenteriska neuron och ICC vid autotransplantation i ls-möss. I delarbete III utvärderades en modell för autotransplantation av myenteriska neuron och ICC till njuren (subkapsulärt) i ls-möss. En god överlevnad av myenteriska neuron och ICC kunde påvisas både hos homozygota och heterozygota ls-möss, vilket indikerar att dessa celler har förmåga att överleva en transplantationsprocedur även i det sjuka modelldjuret. Eventuell transplantation av nervceller som ett alternativ till operation vid intestinal dysmotilitet kräver fortsatta studier för att utvärdera betydelse och nödvändighet av olika faktorer lokalt i tarmväggen. Detta inspirerade oss att studera plasticitet och överlevnad av myenteriska neuron i primärkulturer. Cellodling―En modell för studier av neuronal plasticitet och överlevnad av adulta myenteriska neuron från råttans tunntarm. I delarbete IV kunde vi visa att det är möjligt att studera plasticitet och överlevnad av myenteriska neuron―såväl dissocierade som i intakta ganglier―från adult råtta i primära kulturer. VIP och NO, men inte PACAP ökar överlevnad av adulta myenteriska neuron. Exogent tillfört VIP (delarbete V och VI) och NO (NO-donatorn SNAP; delarbete V) resulterade i en signifikant ökning av antalet överlevande neuron i odling. Dessa fynd styrktes av det faktum att en ökad nervcellsdöd sågs när neuronen odlades i närvaro av VIP-antiserum eller NOS-hämmaren L-NAME (delarbete V)-. Vi kunde däremot inte påvisa någon effekt av PACAP-38 eller PACAP-27 på nervcellsöverlevnad (delarbete VI). Uttryck av VIP, NOS och PACAP i adulta myenteriska neuron. I delarbete IV-VI visade vi att VIP-uttryckande neuron ökade till antalet under odling. Ett förändrat uttryck av flera neuropeptider och NOS har tidigare påvisats i ENS, som svar på olika patologiska tillstånd hos människa och vid experimentellt inducerade förändringar ― inkluderande axotomi och intestinal adaptation. Det ökade uttrycket för vissa neurotransmittorer pekar på dessas betydelse vid neuronal adaptation och för överlevnad. VIP-uppregleringen kvarstod utan tecken till nedreglering under odlingsperioden oberoende av om neuronen var dissocierade eller samlade i ganglier. Den NOS-innehållande neuronala subpopulationen dubblerades efter 8 dagar i odling (dissocierade neuron jämfört med dag 0, delarbete V). Även en diskret ökning av NOS-uttryckande neuron kunde påvisas jämfört med whole mount-preparationer efter 21 dagar vid odling av ganglier (delarbete IV). Det är de NOS-innehållande neuronen som börjar producera VIP, vilket gör att vi får en ökning av neuron som uttrycker både VIP och NOS. Den ökade proportionen av VIP- och NOS-innehållande neuron torde kunna bero på en bättre överlevnad av dessa jämfört med dem som inte producerar VIP eller NO. Beredskapen med vilken VIP och NOS uppregleras som svar på situationen i odling (dvs axotomi), reflekterar förmodligen grundläggande protektiva mekanismer hos dessa neuron. Den ökade andelen VIP- och NO-syntetiserande neuron pekar på kvarstående plasticitet upp i vuxen ålder. Någon uppreglering av PACAP-innehållande neuron i samband med odling kunde däremot inte påvisas. Detta är förvånande eftersom tidigare studier på experimentella modeller för blockad av axonal transport (axotomi och autotransplantation av myenteriska ganglier) visat på en parallell uppreglering av både VIP och PACAP. Även i modellsystem för intestinal adaptation förändras VIP- och PACAP-uttrycket parallellt; vid hypertrofi ökar antalet neuron som innehåller VIP eller PACAP, och vid atrofi minskar dessa. Att närvaro av VIP men ej PACAP påverkar överlevnad av myenteriska neuron visar på möjligheten att det finns en VIP-specifik receptor involverad i neuroprotektion av adulta myenteriska neuron. Konklusion. Sammanfattningsvis har dessa studier visat att: ls-möss utgör en god modell för studier av HSCR. Förändringar i antal neuron och ICC, samt ett förändrat uttryck för vissa neurotransmittorer kunde påvisas även i ganglionär tarm hos homozygota ls-möss, vilket skulle kunna utgöra ett morfologiskt underlag som förklaring till dysmotilitet. En god överlevnad av myenteriska neuron och ICC sågs vid autotransplantation av dessa i ls-möss. I primära kulturer av myenteriska neuron från råttans tunntarm, kunde en ökad neuronöverlevnad påvisas när dessa behandlades med exogent tillsatt VIP och/eller NO. Däremot visade inte PACAP någon effekt på antalet överlevande neuron. Antalet VIP- och NOS-uttryckande neuron ökade under odlingsperioden, medan antalet PACAP-innehållande neuron var konstant. Resultaten tyder på att myenteriska neuron har god förmåga till plasticitet upp i vuxen ålder.