Biosynthesis, Processing, and Sorting of Human Neutrophil Granule Proteins. Focus on Cathepsin G, Proteinase 3, and Azurocidin

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Bildning, bearbetning och upplagring av cathepsin G, proteinas 3 och azurocidin - närbesläktade bakteriedödande proteiner i vita blodkroppar Människans kropp utsätts dagligen för fientliga attacker av olika sorters mikroorganismer, tillhörande bakterie-, virus- eller svampsläktet. Så länge vi är friska och vårt immunförsvar fungerar, kan vi som tur är framgångsrikt försvara oss mot dessa angrepp. Till vår hjälp har vi de vita blodkropparna; celler som är sprängfyllda med bland annat olika antimikrobiella och vävnadsnedbrytande ämnen. De vita blodkropparna, leukocyterna, bildas från hematopoetiska stamceller, primitiva blodbildande celler i benmärgen. Dessa stamceller har en karakteristisk förmåga dels att kunna återbilda sig själva, dels att via ett antal mognadsstadier ge upphov till alla sorters mogna celler som cirkulerar i blodbanan, d.v.s. förutom de vita blodkropparna även röda blodkroppar och blodplättar. Det finns flera typer av vita blodkroppar. Till de professionella fagocyterna, celler som har till uppgift att äta och döda mikroorganismer, räknas de neutrofila granulocyterna. Dessa livsviktiga celler innehåller små korn, granula, i vilka de bakteriedödande substanserna lagras. Det finns tre olika huvudtyper av granula med olika innehåll och funktion; azurofila granula, specifika granula och gelatinas-granula. Vår forskargrupp studerar hur proteiner i de azurofila granula bildas, aktiveras och upplagras. I de arbeten som ingår i min avhandling undersökte vi de närbesläktade proteinerna cathepsin G, proteinas 3 och azurocidin. De två förstnämnda har förutom sin svamp- och bakteriedödande funktion även förmåga att bryta ned bindvävsproteiner för att bana väg för neutrofilen till vävnaderna. I delarbetena I-IV har vi med moderna molekylär- och cellbiologiska metoder, s.k. genteknik, fört över genetisk information som kodar för förstadierna av normalt eller manipulerat cathepsin G, proteinas 3 eller azurocidin, till två olika cellinjer, "odödliga" celler som ger upphov till identiska dotterceller. Dessa celler kan översätta den genetiska informationen till aminosyror, som utgör byggstenarna i proteiner. Cellinjerna, från råtta respektive mus, har med andra ord det syntesmaskineri som behövs för att bilda, bearbeta och upplagra proteiner. Vi undersökte nybildningen av dessa proteiner med radioaktivt inmärkta aminosyror som byggdes in i proteinerna under en begränsad tidsperiod. Vi följde också proteinernas öde i cellens inre rum. Med antikroppar, specifikt riktade mot respektive protein, renade vi sedan fram proteinerna och lät dem vandra på geler i elektriskt laddade fält, som separerade proteinformerna efter deras molekylvikter. Radioaktiviteten på gelerna fick sedan svärta fotografiska filmer och vi kunde se hur proteinernas molekylvikter ändrades i tid och rum. Under transporten från det endoplasmatiska retiklet, d.v.s. det ställe i cellen där proteinförstadierna bildas, till granula, det ställe där proteinerna upplagras i aktiv form, bearbetas förstadierna till mogna proteiner. Ganska tidigt fästs också sockermolekyler på speciella aminosyror i proteinet. Till en början har sockerstrukturerna ett högt innehåll av sockerarten mannos, som sedan omvandlas till komplexa former och trimmas i Golgiapparaten. Det endoplasmatiska retiklet kan alltså betraktas som en fabrik som tillverkar halvfabrikat, medan Golgiapparaten raffinerar produkten. För att "vapnen", d.v.s. de bakteriedödande och vävnadsnedbrytande substanserna, inte ska skada cellen själv på väg till granula, transporteras de med "säkring" på. Säkringen består av en peptidsnutt i ena änden av proteinförstadierna; hos cathepsin G och proteinas 3 består den av två aminosyror. Hos förstadiet av azurocidin finns istället i ena änden en sju aminosyror lång peptid med hittills okänd funktion. I det första delarbetet i min avhandling undersökte vi betydelsen av sockerstrukturen i cathepsin G. Vi ändrade den genetiska informationen, så att sockermolekylen inte skulle kunna fästas på proteinet. Som förväntat blev det genmanipulerade proteinet lättare än vanligt cathepsin G, då det inte innehöll sockermolekyler. Vi kunde också visa att sockermolekylerna på cathepsin G inte spelar någon roll för proteinets transport till granula. I det andra delarbetet tog vi bort den genetiska informationen som kodade för "säkringen" hos cathepsin G. Cellernas överlevnad försämrades eftersom enzymet aktiverades i förtid. Det gick dock utmärkt att uttrycka proteinet när vi dessutom oskadliggjorde det katalytiska sätet, som är väsentligt för att enzymet ska vara aktivt. Detta dubbelt manipulerade protein bildades, bearbetades och lagrades i granula trots att proteinets tredimensionella struktur liknade det mogna proteinets under transporten genom cellens produktionsapparat. I det tredje delarbetet undersökte vi proteinas 3. Proteinas 3 utgör ett autoantigen, d.v.s. ett kroppseget ämne som kroppen bildar antikroppar mot, vid den allvarliga inflammatoriska kärlsjukdomen Wegeners granulomatos, som fr.a. drabbar njurar och lungor. Vi visade att sockermolekyler fäster på två ställen på proteinas 3 och att proteinet bearbetas och upplagras i enzymatiskt aktiv form. Dessutom visade vi att antikroppar från patienter med Wegeners granulomatos specifikt kunde känna igen det bildade proteinet i cellinjerna. I det fjärde delarbetet studerade vi azurocidin. Azurocidin har förmåga att binda till endotoxin, ett bakteriegift som orsakar blodförgiftning. Dessutom kan frisatt azurocidin locka till sig monocyter, vita blodkroppar som ansvarar för den "andra inflammationsvågen". I detta arbete visade vi att den sju aminosyror långa peptiden i ena änden av förstadiet av azurocidin klyvs av i två eller flera steg och involverar minst två olika enzym. I det femte delarbetet använde vi benmärg från frivilliga försökspersoner. Benmärgen renades för att få fram relativt tidiga blodbildande stamceller. Cellerna odlades i närvaro av en tillväxtfaktor som befrämjar utmognad till mogna neutrofila granulocyter. Därefter undersökte vi i vilken ordning granulaproteinerna bildades. Vi visade bland annat att bildningen av cathepsin G, proteinas 3 och azurocidin inte förefaller att påbörjas exakt samtidigt. Sammanfattningsvis bidrar min avhandling till att kartlägga hur proteiner i neutrofila granulocyter bildas och upplagras. Vid vissa elakartade blodsjukdomar, t.ex. akut myeloisk leukemi, är bildningen och upplagringen av granulaproteiner störd. De nyvunna kunskaperna kan därför bidra till en ökad förståelse för hur leukemi uppstår. Kunskaperna kan också underlätta tillverkning av nya peptidantibiotika (om nu detta är önskvärt, med tanke på risken för utveckling av antibiotikaresistens hos bakterier) eller inflammationsdämpande läkemedel för behandling av inflammatoriska sjukdomar, såsom ledsjukdomen reumatoid artrit och luftvägssjukdomarna astma och emfysem.