The significance of urokinase-type plasminogen activator (u-PA) in tumour growth and Linomide-induced upregulation of u-PA's endogenous inhibitor PAI-2

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Den främsta orsaken till att cancer kan leda till döden är att tumörceller växer in i angränsande vävnad (invasiv) och tar sig in i blodet eller lymfsystemet och på så sätt sprids (metastaserar) till andra ställen i kroppen och stör funktionen i livsviktiga organ dvs tumören får ett aggressivt växtsätt. Det är därför viktigt, både ur prognostisk och terapeutisk synvinkel, att öka kunskapen om vad det är som gör att en tumör blir aggressiv. Några viktiga faktorer är cellernas förmåga till vidhäftning, förflyttning samt proteolytisk nedbrytning av extracellulärt matrix (ECM). ECM består av stödjevävnad och basalmembran, som strukturellt och funktionellt förbinder olika vävnader i kroppen. Basalmembran finns också i blodkärlens väggar. Plasmin är ett proteolytiskt enzym som kan bryta ned flera komponenter i ECM och har därför visat sig vara involverat i den invasiva processen vid flera cancerformer. Plasminogenaktivatorer (PA) är serinproteaser, som omvandlar det inaktiva proenzymet plasminogen till aktivt plasmin. Det finns två naturligt förekommande PA; t-PA och u-PA. t-PA är involverad i fibrinolysen i blodet - nedbrytning av blodets trådämne fibrin - och motverkar därigenom bildandet av blodproppar. u-PA är verksamt vid nedbrytning av ECM och vid cellers förflyttning och är därigenom involverad i nybildning och ombyggnad av organ, sårläkning och nybildning av kärl, men även vid sjukliga förändringar som inflammation och cancer. Flera olika forskningsgrupper har visat att mängden u-PA i olika tumörvävnader, t ex bröstcancer, korrelerar till patientens överlevnad. Med andra ord, om det finns höga värden av u-PA är prognosen dålig. PA balanseras huvudsakligen av de två specifika hämmarna PAI-1 och PAI-2. PAI-1 produceras bl a i blodkärlens väggar (endotelceller) och är viktig för balansering av den fibrinolytiska aktiviteten i blodbanan. PAI-2 produceras av celler i moderkakan (placenta) hos gravida. Både PAI-1 och PAI-2 produceras också av monocyter/makrofager som finns i blodet och i vävnader. Avhandlingen grundar sig på fem vetenskapliga uppsatser. I delarbete I beskrivs två olika experimentella tumörmodeller i möss (in vivo). I tidigare studier har jag funnit att cellinjen 1013L som har erhållits från en primär prostatacancer inte producerar u-PA, medan cellinjen DU 145 som har erhållits från en prostatacancermetastas producerar rikliga mängder av u-PA. Eftersom cellinjer som inte producerar u-PA är ovanliga, och 1013L-cellerna erhållits från en primär tumör och ej tidigare karakteriserats in vivo var det av intresse att studera hur dessa celler växer in vivo i immundefekta (SCID) möss jämfört med DU 145-celler. Vi visar i detta delarbete att DU 145-celler, inokulerade under huden i SCID möss, i samtliga fall gav upphov till tumörer som tillväxte snabbt. 1013L-celler gav däremot inte upphov till några tumörer. När 1013L-cellerna fick hjälp och inokulerades tillsammans med ett gelatinmatrix bildades det tumörer i 50% av fallen och dessa tumörer växte mycket långsamt. Dessutom växte 1013L-cellerna, till skillnad från DU 145-cellerna, inte in i angränsande vävnader. Efter avslutat experiment togs tumörerna ut och halterna u-PA, t-PA, PAI-1 och PAI-2 i tumörvävnaderna bestämdes med specifika immunokemiska analysmetoder (ELISA och RIA). DU 145-tumörerna innehöll rikliga mängder av u-PA medan 1013L-tumörerna uppvisade knappt mätbara värden av u-PA, ca 300 gånger lägre än DU 145. Både 1013L och DU 145 saknar t-PA och de båda hämmarna PAI-1 och PAI-2. Därför är detta två bra in vivo-modeller för att testa om u-PA kan vara av betydelse för tumörtillväxten. Ett sätt vore att sätta in u-PA genen i 1013L-celler, som inokuleras i SCID möss, för att se om de får ett aggressivare växtsätt in vivo. Ett annat sätt att klarlägga om u-PA är av betydelse för tumörväxt är att hämma u-PA i DU 145-cellerna, vilket gjordes i delarbete II och III. I delarbete II visar vi att p-aminobenzamidin - som tidigare har visats vara en syntetisk hämmare till u-PA - också kunde hämma u-PA-aktiviteten hos DU 145-cellerna. Möss inokulerades med DU 145-celler, och när tumörer hade bildats behandlades mössen i 23 dagar med p-aminobezamidin i dricksvattnet. Behandlingen med p-aminobenzamidin resulterade i en långsammare tillväxt av tumörerna med en 64% mindre slutlig tumörvikt jämfört med möss som inte hade fått någon behandling. Om hämningen av u-PA aktiviteten med p-aminobenzamidin inte är fullständig, kan plasmin bildas. p-aminobenzamidin kan också hämma plasmin, vilket till en mindre del kan ha bidragit till antitumöreffekten i delarbete II. Därför testades u-PA:s endogena hämmare PAI-2, som inte hämmar plasmin, i delarbete III. Samma in vivo-modell som i delarbete I och II användes. SCID mössen injicerades dagligen med genteknologiskt framställt (rekombinant) PAI-2 (rPAI-2) runt tumörerna och jämfördes med möss som injicerades med koksalt (NaCl). Med rPAI-2-behandling i 22 dagar erhölls en långsammare tillväxt av tumörerna med en 61% lägre slutlig tumörvikt jämfört med möss utan behandling. Vi såg inga bieffekter av rPAI-2 vilket inte heller var förväntat. PAI-2 kan normalt inte mätas i blodet hos människa (<5 ng/ml), men gravida kvinnor har höga mängder av PAI-2 i blodet under graviditeten (upp till 300 ng/ml), vilket tolereras väl. För människor är behandling av maligna sjukdomar med rPAI-2 knappast genomförbart, bl a på grund av svårigheter med administrering under lång tid. Därför skulle det vara av betydelse om man kunde uppreglera kroppens eget PAI-2. I delarbete IV isolerades mononukleära celler (monocyter och lymfocyter) ur venblod från blod-donatorer. Dessa mononukleära celler odlades in vitro med olika koncentrationer av Linomide. Linomide, en substans framställd av Pharmacia & Upjohn AB, har tidigare visats ha effekt i flera tumörmodeller in vivo men också i djurmodeller för autoimmuna sjukdomar. Trots utmärkta resultat in vivo hade Linomide inte tidigare uppvisat någon klar och tydlig effekt i cellodling (in vitro). Vi fann nu att Linomide gav upphov till en signifikant ökning av den totala PAI-2-produktionen i mononukleära celler. Denna effekt av Linomide på PAI-2 var selektiv i det att ingen påverkan på PAI-1-produktionen kunde uppmätas. Behandling med Linomide i olika koncentrationer visade ett dosrelaterat svar både på protein- och mRNA-nivå. In situ-hybridisering visade att PAI-2 mRNA var lokaliserat till monocyter. Genom kliniska försök med Linomide (Pharmacia & Upjohn AB) har vi fått tillgång till mononukleära celler som isolerats ur venblod från friska försökspersoner. Dessa personer hade behandlats med Linomide i 4 dagar och blodprover togs före, under och efter behandlingen. Vi fann en statistiskt signifikant uppreglering av PAI-2 under hela behandlingstiden, dvs både dag 1 och dag 4, vilket redovisas i delarbete V. Med flödescytometri visade vi att PAI-2-proteinet finns i monocyter och att mängden PAI-2 i monocyterna ökades under inverkan av Linomide. Sammanfattningsvis, har det i denna avhandling visats att u-PA är av betydelse för tumörtillväxt genom att tillväxten kan hämmas av den syntetiska u-PA-hämmaren p-aminobenzamidin liksom av den endogena u-PA hämmaren PAI-2. Det har också visats att PAI-2 i monocyter kan uppregleras av Linomide både på protein- och mRNA-nivå i cellodling (in vitro) och att monocyternas produktion av PAI-2 hos människa (in vivo) kan ökas av farmakologiska substanser (Linomide). En strategi för cancer-behandling skulle därför kunna vara att uppreglera kroppens eget PAI-2 i monocyter/makrofager.