DNA repair and the p53 pathway in ischemic and traumatic brain injury

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish BAKGRUND Hjärnskador till följd av otillräckligt blodflöde eller skallskador drabbar varje år ett stort antal människor i vårt land. Otillräckligt blodflöde till hjärnan (cerebral ischemi) uppträder vid en rad kliniska tillstånd, exempelvis slaganfall (stroke), hjärtstillestånd och gravt sänkt blodtryck. Hjärnskador till följd av våld mot huvudet (traumatiska hjärnskador) ses exempelvis vid trafikolyckor. Båda dessa typer av hjärnskador kan leda till förlust av nervceller (neuron) i specifika delar av hjärnan – s.k. selektiv neuronal död. Förlust av nervceller ligger till stor del bakom de neurologiska symptom som ofta blir resultatet av ischemiska och traumatiska hjärnskador. Nervcellsdöden kan uppträda omedelbart, men kan också utvecklas under loppet av timmar till dagar, eller under ännu längre tid. Nervcellerna i hjärnan är extremt känsliga för syrebrist och brist på näringsämnen, framför allt sockerarten glukos. Detta beror delvis på den jämförelsevis höga ämnesomsättningen i hjärnan, samt att energireserverna i detta organ är små. Anledningen till att vissa nervceller är känsligare än andra för upphävt blodflöde och trauma är emellertid okänd. Man vet inte heller varför nervcellsdöden i vissa delar av hjärnan utvecklas så långsamt. I experimentella studier har det visats att nervcellsdöd kan förorsakas av i cellerna inbyggda mekanismer. Man vet att celldöd i hjärnan, liksom i andra delar av kroppen, styrs genom genetiska mekanismer under fosterstadiet – så kallad programmerad celldöd (apoptos). Det finns ett antal gener som uttrycks i hjärnan i djurmodeller för ischemiska och traumatiska hjärnskador, vilka tros vara involverade i nervcellsdöden. I cellkulturer och i genetiskt modifierade djur har man också minskat eller ökat uttrycket av olika gener, och därmed kunnat påverka nervcellsdöden. En av de centrala mekanismerna i regleringen av celldöd kretsar kring tumörsuppressor-genen p53. Denna har stor betydelse för att skydda organismen mot oreglerad celltillväxt, vilket annars kan leda till tumörutveckling. Den centrala roll p53 spelar i skyddet mot tumörer illustreras av det faktum att cirka 50% av all solida tumörer hos människa innehåller mutationer i p53-genen. p53 utför sin skyddande uppgift på flera sätt. Bl.a. kan p53 stoppa cellernas delning och tillväxt (cellcykeln), och därmed motverka tumörbildning. Dessutom är p53 involverat i reparation av cellernas genetiska material (DNA), vilken är nödvändig för att motverka att mutationer uppkommer och leder till dysfunktion i cellerna eller bildandet av tumörer. Slutligen kan p53 starta celldödsmekanismer, om det skulle visa sig omöjligt att reparera skador på exempelvis DNA. p53 kan aktiveras av många olika stimuli, där de viktigaste tros vara skador på DNA och otillräcklig syrgastillförsel till cellerna. Aktiverat p53 utövar sina olika effekter bl.a. genom att fungera som en transkriptionsfaktor, vilket betyder att p53 kan styra aktiviteten (uttrycket) hos andra gener. Syftet med denna avhandling har varit att studera p53s roll i nervcellsdöden i hjärnan efter ischemia och trauma. I avhandlingens första del (arbete I-III) har vi använt en djurexperimentell modell för övergående ischemi hos råtta och studerat nivåerna av p53 och p53-reglerade gener i hippocampus (grek. sjöhäst), ett område i hjärnan med både ischemikänsliga och ischemiresistenta nervceller. Bland de p53-reglerade gener vi studerat finns PCNA (arbete II), som är viktig för DNA-reparation i cellerna. I avhandlingens andra del använde vi en djurmodell för traumatisk hjärnskada på genetiskt modifierade möss, vilka saknade p53-genen eller genen för en viktig DNA-reparationsfaktor, XPA. AKTIVERING AV p53 OCH p53-REGLERADE GENER ÄR ETT SVAR PÅ CELLULÄR STRESS Resultatet av våra studier visar att nivåerna av p53 och den p53-reglerade genen p21WAF1/Cip1 ökar i såväl döende som överlevande nervceller efter ischemi (arbete I). Dessutom ökar uttrycket av dessa gener efter ischemi då försöksdjurets kroppstemperatur sänks några grader (till 33°C), s.k. hypotermi. Det är sedan tidigare känt att hypotermi är ett effektivt skydd mot nervcellsdöd. Dessa resultat antyder att ökade nivåer av p53 inte med nödvändighet leder till nervcellsdöd, vilket tidigare antagits. Istället verkar snabb och övergående uppreglering vara associerat med nervcellsöverlevnad. I arbete III använde vi en modell för ischemisk prekonditionering, vilket innebär att nervcellerna skyddas mot ischemi genom att utsättas för en kort, i sig själv oskadlig, ischemi något dygn tidigare. Detta fenomen har tidigare beskrivits bl.a. i hjärtat. Vi observerade ökade nivåer av p53, liksom av de p53-reglerade generna p21WAF1/Cip1 och PAG608/Wig-1, i ischemikänsliga nervceller i hippocampus efter den korta (prekonditionerande) ischemin. Däremot sågs, till skillnad från i icke prekonditionerad ischemi, ingen ökning efter den andra, längre ischemin. Sammantaget talar dessa resultat för att aktivering av p53 och p53-reglerade gener är uttryck för cellulär stress efter cerebral ischemi. Det förefaller att snabb, övergående aktivering – eller aktivering före ischemin genom prekonditionering - korrelerar med nervcellsöverlevnad snarare än celldöd. Vi studerade dessutom nivåerna av den p53-reglerade DNA-reparationsgenen PCNA i hippocampus efter normoterm (37°C) och hypoterm (33°C) ischemi (arbete II). Våra resultat visar att PCNA-genen aktiveras efter normoterm ischemi i känsliga nervceller, medan nivåerna av PCNA-proteinet minskar i dessa celler. Detta tyder på någon typ av funktionell förändring hos PCNA i ischemikänsliga nervceller, även om våra undersökningar inte ger svar på huruvida PCNA-beroende DNA-reparation ökar eller minskar. I hypoterm ischemi sågs en snabbt övergående aktivering av PCNA-genen i de celler som skyddats mot ischemin av den sänkta temperaturen. Sammantaget visar våra resultat att p53 och p53-reglerade gener aktiveras både i nervceller som dör till följd av cerebral ischemi, och i celler som överlever p.g.a. att de är relativt okänsliga mot ischemi eller skyddas genom hypotermi eller prekonditionering. Resultaten visar vidare att tidsförloppet är av stor betydelse – snabb aktivering av p53-beroende mekanismer tycks leda till cellöverlevnad, medan långsam aktivering leder till nervcellsdöd. p53 OCH DNA-REPARATIONSFAKTORN XPA PÅVERKAR SYMPTOMEN EFTER TRAUMATISK HJÄRNSKADA I avhandlingens andra del (arbete IV & V) visade vi att symptomen efter traumatisk hjärnskada påverkas hos genetiskt modifierade möss som saknar p53-genen eller genen för en viktig DNA-reparationsfaktor (XPA). Hos möss som saknade p53 (arbete IV) sågs minskade neurologiska bortfallssymptom jämfört med genetiskt normala djur en vecka efter skadan. Hos möss som saknade XPA sågs däremot en långsammare återhämtning av neurologisk funktion efter skadan (arbete V). Möss som saknar XPA uppvisade också gravt försämrad inlärningsförmåga fyra veckor efter traumat. Däremot fann vi inga skillnader i nervcellsförlust i hjärnan mellan genetiskt normala djur och sådana som saknade p53 eller XPA. Dessa resultat antyder att p53 inte har någon avgörande betydelse för uppkomsten av den akuta nervcellsdöden efter skalltrauma, i motsats till efter ischemi, där avsaknad av p53 har visats leda till minskad vävnadsförlust. De minskade neurologiska symptomen i möss som saknar p53 kan bero på minskad celldöd i en mindre population av nervceller, vilket vi inte kunde upptäcka med de metoder vi använt. En annan möjlig förklaring är att p53 påverkar nervcellsfunktionen negativt efter traumatisk hjärnskada, så att avsaknad av denna gen leder till mindre uttalade symptom. I studien på traumatisk hjärnskada i djur som saknar XPA visar vi för första gången att avsaknad av en central DNA-reparationsfaktor kan leda till förvärrade symptom efter skallskada. Mest framträdande var den försämrade förmågan till inlärning hos dessa möss fyra veckor efter skadan. De förvärrade symptomen hos möss som saknar XPA förklaras inte av ökad celldöd eller förlust av hjärnvävnad efter traumat. Det är möjligt att minskad förmåga att reparera skadat DNA leder till dysfunktion hos nervcellerna, så att kommunikationen mellan dessa celler fungerar sämre än normalt. SLUTSATS I denna avhandling visas att cerebral ischemi leder till ökade nivåer av p53 och p53-reglerade gener i hjärnan. Denna ökning är inte unik för döende nervceller, som tidigare antagits, utan får istället ses som ett svar på stress, som i gynnsamma fall kan hjälpa cellerna att återhämta sig efter ischemin. Vi visar också att p53 inte är nödvändig för nervcellsdöd efter traumatisk hjärnskada, men att genen kan vara involverad i utvecklandet av neurologiska symptom efter traumat. Vidare visar våra resultat att avsaknad av en central DNA-reparationsfaktor (XPA) leder till förlångsammad återhämtning av neurologisk funktion samt försämrad inlärning efter traumatisk hjärnskada. Våra resultat ger nya insikter i mekanismerna bakom nervcellsdöd och neurologiska symptom vid sjukdomstillstånd såsom stroke, hjärtstillestånd och trauma. De nya kunskaperna kan förhoppningsvis ligga till grund för utvecklandet av nya behandlingsmetoder vid dessa tillstånd.