Magnesium Chelatase: Insights into the first Step of Chlorophyll Biosynthesis

Sammanfattning: Popular Abstract in Swedish Enzymet magnesium-kelatas katalyserar bildandet av magnesium-protoporfyrin genom insättning av en magnesiumjon i protoporfyrin. Detta är det första unika steget i tillverkningen av klorofyll hos växter, alger och fotosyntetiska bakterier. Magnesium-kelatas består av tre proteiner som kallas I (vikt 40 kDa), D (70 kDa) och H (140 kDa). Det är viktigt att bestämma dessa proteiners egenskaper och struktur för att förtså detta inledande katalytiska steg i klorofyllsyntesen. De tre proteinerna är starkt evolutionärt konserverade när man jämför motsvarande proteiner från så pass skilda organismer som purpur icke-svavel bakterier och gröna svavel bakterier till eukaryota växter och cyanobakterier. I artikel I karaktäriseras åtta korn-mutanter som är defekta i H-genen (Xantha-f) på DNA-nivå och deras gula fenotyp kunde därmed förklaras. I den här avhandlingen används ofta magnesium-kelatas från bakterien Rhodobacter capsulatus som modellsystem, då mycket av pionjärarbetet kring magnesium-kelatas har gjort med denna organism. Magnesium-kelatas behöver ATP för att kunna sätta in magnesium i protoporfyrin och det har tidigare föreslagits att H-proteinet skulle kunna omsätta detta ATP. I artikel II visar vi att ATP-hydrolysen bara är associerad till I-proteinet och inte H-proteinet. Den oförutsedda upptäckten av ett järn-svavel-kluster i H-proteinet från R. capsulatus beskrivs i artikel III. Det cystein-motiv som koordinerar järn-svavel-klustret hittas bara i fem fakultativt anaeroba proteobakterier och saknas i aeroba och strikt anaeroba arter. Funktionen av järn-svavel-klustret behöver klargöras. I artikel IV presenteras den första strukturella beskrivningen av H-proteinet. Elektronmikroskopi och ?single-particle? rekonstruering användes för att lösa strukturen med och utan bundet protoporfyrin. De strukturella förändringar proteinet genomgår vid substrat-inbindning visas vid 25 Å upplösning. Dessutom ger proteolysbehandling och analyser av förkortade versioner av H-proteinet bevis för kooperativ bindning av porfyrin-substratet. Bindningen av porfyrin till H-proteinet studeras ytterligare i artikel V med hjälp av tryptofan-fluoroscens och ett bindningsställe med hög affinitet beskrivs. Utbyte av specifika aminosyror i H-proteinet genom riktad mutagenes visar vilka aminosyrer som är viktiga för substratbindning och/eller katalys. De resultat som presenteras i denna avhandling utökar vår förståelse för magnesium-kelataset och då speciellt H-proteinet. Med tre olika protein-komponenter och tre inblandade substrat, så står det klart att magnesium-kelatas är en högt utvecklad molekylär maskin som är vida mer komplicerad än vad som någonsin kunnat förväntas.